Das gesamte Ergebnis eines Bioäquivalenzstudie ruht auf einer einzigen Messung: die Konzentration des Wirkstoffs im Blut. Egal wie gut die Studie ist, wenn diese Messung nicht zuverlässig ist, ist das erhaltene Ergebnis auch nicht zuverlässig. In den vorherigen Artikeln dieser Serie haben wir uns mit Studiendesign, Variabilität und dem regulatorischen Rahmen befasst. In diesem letzten Artikel untersuchen wir die bioanalytische Methodenvalidierung, die das stille Fundament des gesamten Prozesses bildet, und die LC-MS/MS-Technik, mit der diese Messungen heute überwiegend durchgeführt werden.
Was ist eine bioanalytische Methode?
Eine bioanalytische Methode ist die Analysemethode, mit der die Konzentration eines Wirkstoffs in einer biologischen Probe gemessen wird. In einer Bioäquivalenzstudie werden die in definierten Zeitabständen entnommenen Blutproben mit dieser Methode einzeln vermessen. Jede Messung bildet einen Punkt auf der in den früheren Artikeln beschriebenen Konzentrations-Zeit-Kurve. Die Methode ist daher die Quelle aller Daten, die die Studie produziert.
Eine so entscheidende Methode muss sich als zuverlässig erweisen. Dieser Nachweisprozess wird als Methodenvalidierung bezeichnet und wird durch eine gemeinsame Richtlinie auf internationaler Ebene definiert.1 Diese Richtlinie legt fest, unter welchen Bedingungen eine Methode als zuverlässig anzusehen ist und welche ihrer Eigenschaften getestet werden müssen.
Warum LC-MS/MS?
Die Konzentrationen eines Wirkstoffs im Blut sind oft extrem niedrig, und die Probe ist eine komplexe Umgebung mit Tausenden anderer Komponenten. Um in einer solchen Umgebung genau zu messen, sind sowohl eine hohe Empfindlichkeit als auch eine hohe Selektivität erforderlich.
LC-MS/MS bringt diese beiden Anforderungen zusammen. Die Flüssigchromatographie trennt die Komponenten des Gemisches voneinander; die Tandemmassenspektrometrie erkennt und misst dann das Zielmolekül entsprechend seiner Masse. Diese Kombination ermöglicht es, auch sehr geringe Konzentrationen zuverlässig zu messen und von den anderen Substanzen in der Probe zu unterscheiden. Aus diesem Grund ist die in modernen Bioäquivalenzstudien bevorzugte Methode weitgehend diese.
Die zentralen Validierungsparameter
Die Validierung einer Methode bedeutet, sie aus mehreren Blickwinkeln zu testen.2 Jeder dieser Tests sichert eine bestimmte Dimension der Zuverlässigkeit der Messung.
Die Selektivität zeigt, dass die Methode die Zielsubstanz von den anderen Komponenten in der Probe unterscheiden kann. Die Kalibrationskurve definiert den Zusammenhang zwischen dem gemessenen Signal und der tatsächlichen Konzentration und ermöglicht die Berechnung der Konzentration unbekannter Proben. Genauigkeit beschreibt, wie nahe der gemessene Wert dem wahren Wert ist; Präzision beschreibt, wie nahe wiederholte Messungen zueinander sind.
Die untere Bestimmungsgrenze definiert die niedrigste Konzentration, die die Methode zuverlässig messen kann; in Studien, in denen niedrige Konzentrationen von Bedeutung sind, ist diese Grenze entscheidend. Die Wiederfindung zeigt das Ausmaß, in dem die Substanz aus der Probe entnommen werden kann. Carry-over prüft, ob eine Probe die nächste beeinflusst. Die Stabilität bestätigt, dass die Substanz in der Probe unter Lager- und Verarbeitungsbedingungen intakt bleibt.
Matrixeffekt
Unter diesen Parametern ist einer von besonderer Bedeutung für massenspektrometrische Methoden: der Matrixeffekt. Andere Komponenten in der biologischen Probe können das Messsignal der Zielsubstanz verstärken oder unterdrücken. Wird dieser Effekt nicht berücksichtigt, kann die Messung zu systematisch falschen Ergebnissen führen. Aus diesem Grund ist die Bewertung des Matrixeffekts ein separater und kritischer Schritt bei der Validierung von LC-MS/MS-Methoden.
Analyse von Studienproben
Die Validierung ist nicht nur ein Test, der in der Einrichtungsphase des Verfahrens durchgeführt wird. Die Methode muss auch gezeigt werden, um ihre Zuverlässigkeit zu erhalten, während die tatsächlichen Studienproben analysiert werden. Dazu werden einige Proben zu einem anderen Zeitpunkt erneut vermessen und auf Konsistenz mit dem ersten Ergebnis überprüft. Diese Überprüfung bestätigt, dass die Messung nicht nur unter idealen Bedingungen, sondern auch innerhalb des realen Studienflusses zuverlässig ist.
Ein einheitlicher internationaler Rahmen
In der Vergangenheit hatten verschiedene Regionen separate Richtlinien für die Validierung bioanalytischer Methoden.23 Diese Richtlinien wurden lange Zeit parallel verwendet. Die gemeinsame internationale Leitlinie Diese Ansätze wurden später in einem einzigen Rahmen zusammengeführt und sind heute zum gemeinsamen Standard geworden, der von den großen Behörden angenommen wurde.1 Auch Türkiye stützt sich in diesem Bereich auf international anerkannte Prinzipien; so sprechen die in einem türkischen Zentrum produzierten Daten international dieselbe Sprache.
Die Rolle von NanoTox
In dieser Serie wiederholte sich ein Satz: Selbst die am besten konzipierte Studie verliert ihre Bedeutung, wenn die Messung nicht zuverlässig ist. Die Validierung bioanalytischer Methoden ist genau der Schritt, der diese Zuverlässigkeit bietet. Als Zentrum, das für die Durchführung dieser Studien autorisiert ist, nutzt NanoTox seine LC-MS/MS-Infrastruktur mit nach internationalen Richtlinien validierten Methoden. Eine genaue, selektive und reproduzierbare Messung auch bei niedrigen Konzentrationen ist für uns kein Ziel, sondern eine Voraussetzung der Studie. Die wissenschaftliche Robustheit hinter einem Bioäquivalenzergebnis entsteht aus genau dieser Grundlage.
Referenzen
1 ICH M10 Bioanalytische Methodenvalidierung und Probenanalyse (Schritt 4, 24.05.2022). https://database.ich.org/sites/default/files/M10 Guideline Step4 2022 0524.pdf
2 US-amerikanische Food and Drug Administration. Bioanalytische Methodenvalidierung — Leitfaden für die Industrie (Mai 2018). https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/bioanalytical-method-validation-guidance-industry
3 Europäische Arzneimittel-Agentur. Leitlinie zur Validierung bioanalytischer Methoden (EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev. 1). https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-bioanalytical-method-validation en.pdf
