Tout le résultat de étude de bioéquivalence repose sur une seule mesure : la concentration du principe actif dans le sang. Peu importe à quel point l'étude est bien conçue, si cette mesure n'est pas fiable, le résultat obtenu n'est pas fiable non plus. Dans les articles précédents de cette série, nous avons abordé la conception, la variabilité et le cadre réglementaire de l'étude. Dans cet article final, nous examinons la validation des méthodes bioanalytiques, qui est à la base silencieuse de l'ensemble du processus, et la technique LC-MS/MS avec laquelle ces mesures sont principalement faites aujourd'hui.
Qu'est-ce qu'une méthode bioanalytique?
Une méthode bioanalytique est la méthode analytique qui mesure la concentration d'un ingrédient actif dans un échantillon biologique. Dans une étude de bioéquivalence, les échantillons de sang prélevés auprès des participants à des intervalles de temps définis sont mesurés un par un avec cette méthode. Chaque mesure forme un point sur la courbe de concentration-temps décrite dans les articles précédents. La méthode est donc la source de toutes les données produites par l'étude.
Une méthode aussi décisive doit être prouvée fiable. Ce processus de preuve est appelé validation de la méthode et est défini par une directive commune à l'échelle internationale1. La présente ligne directrice énonce les conditions dans lesquelles une méthode doit être considérée comme fiable et quelles caractéristiques doivent être testées.
Pourquoi LC-MS/MS?
Les concentrations d'un ingrédient actif dans le sang sont souvent extrêmement faibles, et l'échantillon est un environnement complexe contenant des milliers d'autres composants. Pour mesurer avec précision dans un tel environnement, il faut une sensibilité élevée et une sélectivité élevée.
LC-MS/MS réunit ces deux exigences. La chromatographie liquide sépare les composants du mélange les uns des autres; la spectrométrie de masse en tandem reconnaît ensuite et mesure la molécule cible en fonction de sa masse. Cette combinaison permet de mesurer de manière fiable même les très faibles concentrations, en les distinguant des autres substances de l'échantillon. Pour cette raison, la méthode préférée dans les études modernes de bioéquivalence est en grande partie celle-ci.
Paramètres de validation de base
Valider une méthode signifie la tester sous plusieurs angles2. Chacun de ces tests assure une dimension particulière de la fiabilité de la mesure.
La sélectivité montre que la méthode peut distinguer la substance cible des autres composants de l'échantillon. La courbe d'étalonnage définit la relation entre le signal mesuré et la concentration réelle et permet de calculer la concentration d'échantillons inconnus. La précision décrit à quel point la valeur mesurée est proche de la valeur réelle; la précision décrit à quel point les mesures répétées sont proches les unes des autres.
La limite inférieure de quantification définit la concentration la plus faible que la méthode puisse mesurer de façon fiable; dans les études où la matière est faible, cette limite est déterminante. La récupération montre dans quelle mesure la substance peut être extraite de l'échantillon. Le report vérifie si un échantillon affecte le suivant. La stabilité confirme que la substance demeure intacte dans l'échantillon dans des conditions de stockage et de transformation.
Effet matriciel
Parmi ces paramètres, il y a une importance particulière pour les méthodes basées sur la spectrométrie de masse: l'effet de matrice. D'autres composants de l'échantillon biologique peuvent améliorer ou supprimer le signal de mesure de la substance cible. Si cet effet n'est pas pris en compte, la mesure peut donner des résultats systématiquement incorrects. Pour cette raison, l'évaluation de l'effet de la matrice est une étape distincte et critique de la validation des méthodes LC-MS/MS.
Analyse des échantillons d'étude
La validation n'est pas seulement un essai effectué au stade de l'installation de la méthode. La méthode doit également être démontrée pour maintenir sa fiabilité pendant l'analyse des échantillons d'étude. Pour cela, certains échantillons sont à nouveau mesurés à un moment différent et vérifiés pour la cohérence avec le premier résultat. Ce contrôle confirme que la mesure est fiable non seulement dans des conditions idéales mais aussi dans le flux réel de l'étude.
Un cadre international unique
Dans le passé, différentes régions avaient des lignes directrices distinctes pour la validation des méthodes bioanalytiques23. Ces lignes directrices ont été utilisées en parallèle pendant longtemps. La directive internationale commune La Commission a adopté une proposition de directive sur la protection des données à caractère personnel. Türkiye, lui aussi, prend pour base les principes internationalement reconnus dans ce domaine ; de cette manière, les données produites dans un centre turc parlent la même langue à l'échelle internationale.
Rôle des nanotoxs
Tout au long de cette série, une phrase est revenue : même l'étude la mieux conçue perd son sens si la mesure n'est pas fiable. La validation des méthodes bioanalytiques est précisément l'étape qui fournit cette fiabilité. En tant que centre autorisé à mener ces études, NanoTox utilise son infrastructure LC-MS/MS avec des méthodes validées conformément aux lignes directrices internationales. Une mesure précise, sélective et reproductible, même à de faibles concentrations, n'est pas pour nous un objectif mais une condition préalable à l'étude. La robustesse scientifique derrière un résultat de bioéquivalence naît exactement de cette fondation.
Références
1 ICH M10. Validation des méthodes bioanalytiques et analyse des échantillons d'étude (étape 4, 24.05.2022). https://database.ich.org/sites/default/files/M10 Guideline Step4 2022 0524.pdf
2 U.S. Food and Drug Administration. Validation de la méthode bioanalytique — Orientation pour l'industrie (mai 2018). https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/bioanalytic-method-validation-guidance-industrie
3 Agence européenne des médicaments. Ligne directrice sur la validation des méthodes bioanalytiques (EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev. 1). https://www.ema.europa.eu/fr/documents/scientifique-guideline/guideline-bioanalytic-method-validation fr.pdf
