OCDE TG 442C / 442D / 442E: Experiencia de campo con 2o3 DA y alternativas in Vitro en Sensibilización de la piel

La evaluación de la sensibilización de la piel es un componente indispensable de la seguridad de los productos en las industrias de cosméticos, farmacéuticos, plaguicidas y dispositivos médicos. Tradicionalmente, esta evaluación se llevó a cabo utilizando pruebas sobre modelos animales (LLNA, GPMT, Buehler); sin embargo, de conformidad con los principios 3R y los avances científicos, validados en chemico y in vitro los métodos han llegado a la vanguardia. En el centro de esta transformación está OCDE TG 442C (DPRA), OCDE TG 442D (KeratinoSensTM) y OCDE TG 442E (h-CLAT), junto con el 2o3 Enfoque Definido (DA) que combina estas tres pruebas.

Una parte significativa de los estudios de sensibilización de la piel que hemos realizado en nuestro laboratorio durante los últimos dos años ha implicado estos tres estudios en chemico/in vitro métodos. En particular, la prohibición completa de las pruebas de animales bajo el Reglamento de Cosméticos de la UE ha hecho que estas pruebas sean obligatorias para los fabricantes. Sin embargo, nuestra experiencia de campo muestra que los tres ensayos tienen sus propias fortalezas y debilidades únicas, y que el 2o3 DA sólo produce resultados fiables cuando se interpreta correctamente.

OCDE TG 442C (DPRA): En la medición Chemico de la fijación de proteínas

OCDE TG 442C es un en chemico prueba dirigida al primer evento clave (KE1) de la sensibilización de la piel AOP. Las sustancias sensibleras son típicamente electrofílicas en la naturaleza y forman vínculos covalentes con las porciones nucleófilas de proteínas de la piel (cisteine y residuos de lisina). DPRA utiliza péptidos sintéticos (contiene cisteína y lisina) para modelar esta reacción y mide la disminución de la concentración de péptidos a través de HPLC después de la incubación con la sustancia de prueba [citación:1][citación:2].

El problema más común que encontramos al realizar DPRA en nuestro laboratorio es la solubilidad de la sustancia de prueba. El protocolo especifica que la sustancia de prueba debe ser soluble en una concentración de 100 mM; sin embargo, esto no siempre es posible con muestras lipofílicas o aquellas que contienen partículas. In an assessment conducted under the UK REACH framework, it was reported that some substances could not be testing in DPRA due to the lack of a appropriate solvent, and this situation led to a return to animal testing [citation:5]. Nuestra solución es reportar el resultado como "indeterminado" para sustancias con baja solubilidad y evaluarlas conjuntamente con los otros componentes de 2o3 DA. Además, el DPRA no es adecuado para compuestos metálicos y sustancias que exhiben propiedades oxidativas; esta limitación se indica claramente en nuestros informes [citación:8].

La ventaja más importante del DPRA es que es rápida y rentable; sin embargo, no es suficiente por sí solo para determinar el potencial de sensibilización. Por lo tanto, se utiliza como fuente de información dentro del 2o3 DA.

OCDE TG 442D (KeratinoSensTM): Medición de la activación de Keratinocyte

OCDE TG 442D es un in vitro prueba dirigida al segundo evento clave (KE2) del AOP. KeratinoSensTM es una línea de células reporteras creada por transfectar la línea de células de queratinocito humano (HaCaT) con el gen luciferase. Después de 48 horas de exposición a la sustancia de prueba, la activación de la vía Nrf2-ARE se mide por inducción de luciferasa [citación:3][citación:15].

En nuestra experiencia de campo, KeratinoSensTM demostró alta precisión, especialmente con materias primas cosméticas. Sin embargo, un caso llamó nuestra atención: En una muestra de extracto de planta, el resultado KeratinoSensTM cayó dentro del rango "indeterminado" (valor Imax entre 1.35- y 1.67-fold). De acuerdo con las directrices 2o3 DA, en este caso, las otras dos pruebas (DPRA y h-CLAT) deben ser consistentes y altamente confiables [citación:12]. La prueba DPRA fue negativa, mientras que la prueba h-CLAT fue positiva; debido a esta inconsistencia, el resultado 2o3 DA fue reportado como "indeterminado". Le informamos al cliente que el potencial de sensibilización de este extracto no puede ser definitivamente clasificado y que información adicional (por ejemplo, caracterización química o en silico modelado) era necesario. Este caso demuestra lo crítico que es interpretar correctamente los resultados "indeterminados" para 2o3 DA.

OCDE TG 442E (h-CLAT): Medición de la activación de células dendríticas

OCDE TG 442E cubiertas in vitro pruebas dirigidas al tercer evento clave (KE3) del AOP. Tres métodos se definen dentro de esta directriz: h-CLAT, U-SENSTM y IL-8 Luc. h-CLAT mide el aumento de la expresión de los marcadores de superficie CD54 y CD86 en una línea de células monocíticas humanas (THP-1) utilizando la citometría de flujo [citación:4] [citación:10].

El punto más importante que consideramos al realizar h-CLAT en nuestro laboratorio es que los resultados negativos para las sustancias con un Log P = 3.5 tienen baja confiabilidad [citación:12]. Esto se debe a sustancias lipofílicas que no disuelven suficientemente en el medio de cultivo celular. Un ingrediente activo en un plaguicida (con un valor Log P de 4.2) dio un resultado negativo en el h-CLAT; sin embargo, no interpretamos este resultado por sí solo como "no un sensibilizador". Los resultados de DPRA y KeratinoSensTM también se consideraron dentro del alcance de 2o3 DA, y puesto que ambos fueron positivos, el resultado final fue reportado como "sensibilizador". Este es un ejemplo concreto de por qué h-CLAT no debe ser utilizado en aislamiento.

En el cuadro que figura a continuación se presenta un resumen comparativo de las características principales de las directrices TG 442C, 442D y 442E de la OCDE.

2o3 Enfoque Definido: Interpretación Integrada de Tres Pruebas

2o3 pretende determinar el potencial de sensibilización de la piel sin el uso de animales combinando DA, DPRA, KeratinoSensTM y resultados h-CLAT. En virtud de este enfoque, aceptado en el marco del GT 497, la norma básica es la siguiente: Si al menos dos de las tres pruebas son positivas, la sustancia se clasifica como un "sensibilizador"; si al menos dos son negativos, se clasifica como "no un sensibilizador". Sin embargo, si uno de los resultados cae dentro del rango "indeterminado" o si las limitaciones de las pruebas entran en juego, el resultado de DA puede ser "indeterminado" [citación:12].

Al aplicar el 2o3 DA en nuestro laboratorio, reportamos los resultados de cada prueba por separado y presentamos el resultado final del DA junto con nuestra racionalidad. Por ejemplo, para un conservante cosmético, el DPRA era positivo, el KeratinoSensTM era positivo, y el h-CLAT cayó dentro del rango indeterminado. Los dos resultados positivos fueron suficientes para que el DA concluyera que la sustancia era un "sensibilizador", aunque el resultado h-CLAT era indeterminado. Le informamos al cliente que esta sustancia debe clasificarse como GHS Categoría 1 y que la declaración "Puede causar una reacción alérgica a la piel" debe ser utilizada en la etiqueta.

La ventaja más significativa del 2o3 DA es que elimina completamente el uso de animales y es aceptada por las autoridades reguladoras. Sin embargo, nuestra experiencia de campo muestra que la interpretación correcta de los resultados "ambiguous" de DA es crítica. Según datos REACH del Reino Unido, para algunas sustancias, in vitro Las pruebas han demostrado ser insuficientes, lo que ha llevado a un retorno a las pruebas de animales; las principales razones incluyen problemas de solubilidad, sustancias UVCB e incompatibilidad con sistemas de prueba [citación:5]. Por esta razón, nuestro laboratorio evalúa minuciosamente las propiedades fisicoquímicas de la sustancia de prueba antes de cada estudio y verifica la aplicabilidad del 2o3 DA con antelación.

Aplicación de 2o3 DA y Observaciones de Campo en Nuestro Laboratorio

En nuestro laboratorio certificado por GLP, ofrecemos pruebas integradas bajo el marco 2o3 DA para pruebas cubiertas por TG 442C, 442D y 442E de la OCDE. Nuestro proceso de prueba comienza con una evaluación preliminar completa: se examinan la solubilidad, la lipofilia (Log P), la clase química y las posibles interferencias. Sobre la base de esta información, se toma una decisión sobre la aplicabilidad del 2o3 DA.

Las sustancias que hemos evaluado utilizando el 2o3 DA en los últimos dos años incluyen conservantes cosméticos, extractos de plantas, ingredientes activos en pesticidas y extractos de dispositivos médicos. El reto más común que enfrentamos es probar mezclas complejas, como extractos de plantas. Pruebas como DPRA y KeratinoSensTM proporcionan información limitada para mezclas complejas; en tales casos, el enfoque más adecuado es informar de los resultados como "indeterminados" y recomendar información adicional al cliente (por ejemplo, caracterización química o en silico modelado).

Otra observación del campo es la dificultad de aplicar 2o3 DA a extractos de dispositivos médicos. El estándar ISO 10993-10:2021 para dispositivos médicos especifica GPMT, Buehler o LLNA para la evaluación de la sensibilización; sin embargo, 2o3 DA no siempre puede ser adecuado debido a la complejidad de los extractos del dispositivo. En tales casos, trabajamos con el cliente para determinar la estrategia de prueba más adecuada y, cuando sea necesario, también evaluar la in vivo Opción de prueba.

Preguntas Frecuentes

Una de las preguntas más comunes que recibimos con respecto a la OCDE TG 442C, 442D y 442E es si solo 2o3 DA es suficiente. La respuesta depende de las características de la sustancia de prueba. Para sustancias con buena solubilidad, ningún contenido de metal, y un valor Log P inferior a 3.5, 2o3 DA es generalmente suficiente. Sin embargo, para sustancias con problemas de solubilidad, sustancias UVCB o mezclas complejas, DA puede producir un resultado "indeterminado"; en tales casos, se requiere información adicional.

En cuanto a la duración de la prueba, la duración total de las tres pruebas es generalmente de 3 a 4 semanas (incluidos los informes). El DPRA toma 1 semana, KeratinoSensTM tarda 2 semanas, y h-CLAT tarda 2-3 semanas; sin embargo, ya que las pruebas se pueden realizar en paralelo, la duración total se reduce. En cuanto a qué ensayo es adecuado para qué sustancia, el DPRA proporciona información específica para sustancias con alta reactividad de proteínas, KeratinoSensTM para sustancias que muestran activación de queratinocitos, y h-CLAT para sustancias con potencial para activar células dendritas. Sin embargo, no deben usarse en aislamiento sino más bien como parte del 2o3 DA.

En la evaluación de la sensibilización de la piel, el 2o3 DA es un enfoque moderno que elimina el uso de animales y es reconocido por las autoridades reguladoras. Con nuestras pruebas totalmente compatibles con los estándares TG 442C, 442D y 442E de la OCDE, evaluamos el potencial de sensibilización de sus productos según los estándares científicos más altos. Nuestro laboratorio certificado por GLP, con sus sistemas de prueba validados, personal experimentado y experiencia en el campo, es su socio confiable para las necesidades de pruebas de detección de la piel. Para demostrar el perfil de sensibilización de su producto, póngase en contacto con nosotros.