经合组织 TG 442C / 442D / 442E: 皮肤感知2o3 DA和Vitro替代品的实地经验

皮肤敏感性评估是化妆品、药品、杀虫剂和医疗器械行业产品安全不可或缺的组成部分。 传统上,这种评估是通过对动物模型(LLNA、GPMT、Buehler)的测试进行的;但是,根据3R原则和科学进步,经过验证 在化学中 和 试管 方法已经摆在首位。 这种转变的核心是 经合组织TG 442C(开发署), 经合组织 TG 442D (KeratinoSensTM) 和 经合组织 TG 442E (h-CLAT),连同 2o3 界定办法(DA) 结合这三项测试。

过去两年来,我们在实验室进行的皮肤敏化研究中有很大一部分涉及这三个人。 在化学中/试管 方法。 。 。 特别是欧盟化妆品条例全面禁止动物试验,使制造商必须进行这些试验。 然而,我们的实地经验表明,这三项测试都有各自的独特长处和弱点,2o3 DA只有在正确解释时才会产生可靠结果.

经合组织 TG 442C (DPRA):在蛋白质捆绑的化学测量中

经合组织 TG 442C 是一个 在化学中 测试针对皮肤敏化AOP的第一个关键事件(KE1). 敏感物质在自然界中通常具有电感应性,并与皮肤蛋白的核糖体部分(细胞和赖氨酸残基)形成共价结合. DPRA使用合成肽(含囊氨酸和赖氨酸)来建模这种反应,并用试验物质孵化后通过HPLC测量肽浓度的降低[引文:1][引文:2].

我们在实验室执行DPRA时遇到的最常见的问题是试验物质的溶解性. 议定书规定,试验物质应可溶于100毫米的浓度;但是,对脂质样品或含有颗粒的样品而言,并不总是能够溶解。 在英国REACH框架下进行的一项评估中,据报道,由于缺乏合适的溶剂,一些物质无法在DPRA中进行测试,这种情况导致动物测试的恢复[引用:5]. 我们的解决方案是报告低溶性物质的"不确定"结果,并与2o3 DA的其他成分一起评估. 此外,DPRA不适合具有氧化性能的金属化合物和物质;我们的报告[引文:8]明确阐述了这一限制。

达尔富尔地区管理局最显著的优势是它速度快,成本效益高;但是,单靠它不足以确定宣传潜力。 因此,它被用作2o3 DA内部的信息来源。

经合组织 TG 442D (KeratinoSensTM):Keratino细胞活化的测量

经合组织 TG 442D 是一个 试管 测试目标为 AOP 的第二个关键事件(KE2)。 KeratinoSensTM是一款通过将人类的克赖特诺细胞线(HaCaT)与luciferase基因相交而形成的记者细胞线. 在48小时暴露于试验物质后,Nrf2-ARE路径的活化通过润滑剂诱导[引文:3][引文:15]进行测量.

在我们的实地经验中,KeratinoSensTM表现出高度准确性,特别是在化妆品原料方面。 然而,有一个案例引起了我们的注意:在一个植物提取样品中,KeratinoSensTM的结果属于"不确定"范围(最大值在1.35-1.67倍之间). 根据2o3 DA准则,在这种情况下,其他两项测试(DPRA和h-CLAT)必须一致并高度可靠[引文:12]. DPRA测试为阴性,而h-CLAT测试为阳性;由于这种不一致,2o3 DA结果被报告为"不确定". 我们告诉客户,这种提取物的能见度潜力无法明确分类,另外的信息(例如化学特性或化学特性)也无法确定。 以硅为单位 需要建模)。 这个案例证明了正确解释2o3 DA的"不确定"结果有多关键.

经合组织TG 442E(h-CLAT):牙科细胞活性测量

经合组织 TG 442E 覆盖 试管 测试针对AOP的第三个关键事件(KE3). 本准则中定义了三种方法:h-CLAT,U-SENSTM,和IL-8 Luc. h-CLAT用流体细胞测量法[引用:4][引用:10]测量人单细胞细胞线(THP-1)中表面标记CD54和CD86的表达增加.

我们在实验室执行h-CLAT时考虑的最重要一点是,使用log P > 3.5的物质的负结果可靠性较低[引文:12]。 这是由于脂质物质在细胞培养介质中未充分分解. 农药中的活性成分(log P值为4.2)对h-CLAT产生了负结果;然而,我们并没有将这一结果单独解释为"不是敏化剂". DPRA和KeratinoSensTM的结果也在2o3 DA范围内被考虑,由于两者均为正值,最终结果被报告为"敏化剂". 这是h-CLAT不应单独使用的具体例子。

下表提供了经合组织第442C号、第442D号和第442E号准则的主要特点的比较摘要。

2o3 定义方法:综合解释三项试验

2o3旨在将DA、DPRA、KeratinoSensTM和h-CLAT结果结合起来,确定皮肤敏化潜力,而不使用动物。 根据经合组织第497号总协定接受的这种做法,基本规则如下: 如果三次试验中至少有两次阳性,则该物质被归类为"敏化剂";如果至少两次为阴性,则被归类为"不是敏化剂". 然而,如果其中一个结果属于"不确定"范围,或者如果测试的局限性被运用,DA结果可能是"不确定"[引用:12].

在我们实验室应用2o3DA时,我们分别报告每次测试的结果,并介绍最后DA结果和我们的理由。 例如,对于一种化妆品防腐剂,DPRA是正的,KeratinoSensTM是正的,h-CLAT属于不确定范围. 这两个积极的结果足以使地方检察官得出结论,该物质是一种"敏化剂",尽管h-CLAT的结果是不确定的. 我们告知客户,这种物质必须被归类为GHS 第1类,标签上必须使用"可能导致皮肤过敏反应"的说法.

2o3 DA最显著的优势在于它完全消除了对动物的使用并被监管当局所接受. 然而,我们的实地经验表明,正确解释DA的"矛盾"结果至关重要. 根据联合王国REACH的数据,对于某些物质, 试管 试验证明不够充分,导致恢复动物试验;主要原因包括溶解性问题、紫外线生物蓄能物质以及与试验系统不相容[引文:5]。 为此,我们的实验室在每次研究之前对试验物质的物理化学性质进行彻底评估,并事先核实2o3 DA的适用性.

在我们的实验室应用2o3 DA和实地观测

在我们的GLP认证实验室中,我们根据2o3 DA框架提供综合测试,用于经合组织TG 442C、442D和442E的测试。 我们的测试过程从一个全面的初步评估开始:测试物质的溶解性、亲脂性(Log P)、化学类和潜在干扰都经过了检查。 根据这一资料,就2o3 DA的适用性作出决定。

在过去两年中,我们使用2o3 DA评估的物质包括化妆防腐剂、植物提取物、杀虫剂活性成分和医疗器械提取物。 我们面临的最常见挑战是测试复杂的混合物,例如植物提取物. DPRA和KeratinoSensTM等测试为复杂的混合物提供了有限的信息;在这种情况下,最适当的方法是将结果报告为"不确定"并向客户提供补充信息(例如化学特性或化学特性)。 以硅为单位 建模设计).

现场的另一项观察是将2o3 DA应用到医疗器械提取物上的难度. ISO 10993-10:2021医疗器械标准具体规定了GPMT,Buehler,或LLNA用于敏化评估;然而,2o3 DA由于设备提取物的复杂性,可能并不总是合适. 在这种情况下,我们与客户合作,确定最适当的测试战略,并视需要评估 阴道 测试选项。

常见问题

我们收到的关于经合组织TG 442C、442D和442E的最常见问题之一是仅2o3 DA是否足够。 答案取决于试验物质的特性. 对于溶解性好、无金属含量、log P值低于3.5、2o3 DA的物质,一般都足够。 然而,对于有溶解性问题的物质、紫外氯苯物质或复杂的混合物,DA可能会产生"不确定"的结果;在这种情况下,需要提供补充资料。

关于试验时间,三次试验的总时间一般为3至4周(包括报告)。 DPRA需要1周,KeratinoSensTM需要2周,h-CLAT需要2至3周;然而,由于可以同时进行测试,总持续时间被缩短. 至于哪种试验适合哪种物质,DPRA专门为具有高蛋白活性的物质提供信息,KeratinoSensTM为显示煤氨基细胞活化的物质提供信息,h-CLAT为有可能活化腺细胞的物质提供信息。 然而,它们不应孤立地使用,而应作为2o3 DA的一部分。

在皮肤敏化评估中,2o3 DA是一种现代方法,可以去除对动物的使用并被监管机构所认可. 由于我们的测试完全符合经合组织的TG 442C、442D和442E标准,我们按照最高科学标准评估了你们产品的宣传潜力。 我们的GLP认证实验室,拥有经过验证的测试系统,有经验的工作人员,以及实地专家,是您在皮肤敏化测试需求方面的可靠合作伙伴. 请联系我们,以显示您的产品在敏感度上的特征。