OECD TG 442C / 442D / 442E: Felderfahrung mit 2o3 DA und In-vitro-Alternativen zur Hautsensibilisierung

Die Bewertung der Hautsensibilisierung ist ein unverzichtbarer Bestandteil der Produktsicherheit in der Kosmetik-, Pharma-, Pestizid- und Medizintechnikindustrie. Traditionell wurde diese Bewertung an Tiermodellen (LLNA, GPMT, Bühler) durchgeführt, jedoch in Übereinstimmung mit den 3R-Prinzipien und wissenschaftlichen Fortschritten validiert. in der Chemie und in vitro Die Methoden sind in den Vordergrund gerückt. Im Zentrum dieser Transformation steht OECD TG 442C (DPRA), OECD TG 442D (KeratinoSensTM) und OECD TG 442E (h-CLAT)zusammen mit dem 2o3 Defined Approach (DA) Das kombiniert diese drei Tests.

Ein erheblicher Teil der Hautsensibilisierungsstudien, die wir in den letzten zwei Jahren in unserem Labor durchgeführt haben, hat diese drei in der Chemie/in vitro Methoden. Insbesondere das vollständige Verbot von Tierversuchen gemäß der EU-Kosmetikverordnung hat diese Tests für Hersteller obligatorisch gemacht. Unsere Felderfahrung zeigt jedoch, dass alle drei Tests ihre eigenen Stärken und Schwächen haben und dass der 2o3 DA nur dann zuverlässige Ergebnisse liefert, wenn er richtig interpretiert wird.

OECD TG 442C (DPRA): In Chemico Measurement of Protein Binding

OECD TG 442C ist eine in der Chemie Test zum Targeting des ersten Schlüsselereignisses (KE1) der Hautsensibilisierung AOP. Sensibilisierende Substanzen sind typischerweise elektrophiler Natur und bilden kovalente Bindungen mit den nukleophilen Anteilen von Hautproteinen (Cystein- und Lysinresten). DPRA verwendet synthetische Peptide (die Cystein und Lysin enthalten), um diese Reaktion zu modellieren, und misst die Abnahme der Peptidkonzentration über HPLC nach Inkubation mit der Testsubstanz [Zitat:1][Zitat:2].

Das häufigste Problem bei der Durchführung von DPRA in unserem Labor ist die Löslichkeit der Testsubstanz. Das Protokoll legt fest, dass die Prüfsubstanz bei einer Konzentration von 100 mM löslich sein sollte; dies ist jedoch bei lipophilen Proben oder solchen, die Partikel enthalten, nicht immer möglich. In einer im Rahmen des britischen REACH-Rahmens durchgeführten Bewertung wurde berichtet, dass einige Substanzen aufgrund des Mangels an einem geeigneten Lösungsmittel nicht in DPRA getestet werden konnten, und diese Situation führte zu einer Rückkehr zu Tierversuchen [Zitat: 5]. Unsere Lösung besteht darin, das Ergebnis für Substanzen mit geringer Löslichkeit als "unbestimmt" zu melden und in Verbindung mit den anderen Komponenten von 2o3 DA zu bewerten. Darüber hinaus ist die DPRA nicht für Metallverbindungen und Substanzen geeignet, die oxidative Eigenschaften aufweisen; diese Einschränkung wird in unseren Berichten [Zitat:8] deutlich festgestellt.

Der wichtigste Vorteil der DPRA ist, dass sie schnell und kostengünstig ist; sie reicht jedoch nicht aus, um das Sensibilisierungspotenzial zu bestimmen. Daher wird es als Informationsquelle innerhalb des 2o3 DA verwendet.

OECD TG 442D (KeratinoSensTM): Messung der Keratinozytenaktivierung

OECD TG 442D ist eine in vitro Test für das zweite Schlüsselereignis (KE2) des AOP. KeratinoSensTM ist eine Reporter-Zelllinie, die durch Transfektion der menschlichen Keratinozyten-Zelllinie (HaCaT) mit dem Luciferase-Gen erzeugt wird. Nach 48-stündiger Exposition gegenüber der Prüfsubstanz wird die Aktivierung des Nrf2-ARE-Signalwegs durch Luciferaseinduktion [Zitat:3][Zitat:15] gemessen.

In unserer Erfahrung vor Ort zeigte KeratinoSensTM eine hohe Genauigkeit, insbesondere bei kosmetischen Rohstoffen. Ein Fall erregte jedoch unsere Aufmerksamkeit: In einer Pflanzenextraktprobe fiel das KeratinoSensTM-Ergebnis im "unbestimmten" Bereich (Imax-Wert zwischen 1,35- und 1,67-fach). Gemäß 2o3 DA-Richtlinien müssen in diesem Fall die beiden anderen Tests (DPRA und h-CLAT) konsistent und sehr zuverlässig sein [Zitat:12]. Der DPRA-Test war negativ, während der h-CLAT-Test positiv war; aufgrund dieser Inkonsistenz wurde das 2o3 DA-Ergebnis als "unbestimmt" gemeldet. Wir haben den Kunden darüber informiert, dass das Sensibilisierungspotenzial dieses Extrakts nicht endgültig klassifiziert werden kann und dass zusätzliche Informationen (z. B. chemische Charakterisierung oder in silico Modellierung erforderlich. Dieser Fall zeigt, wie wichtig es ist, die "unbestimmten" Ergebnisse für 2o3 DA richtig zu interpretieren.

OECD TG 442E (h-CLAT): Messung der Dendritischen Zellaktivierung

OECD TG 442E Decken in vitro Tests für das dritte Schlüsselereignis (KE3) des AOP. In dieser Richtlinie sind drei Methoden definiert: h-CLAT, U-SENSTM und IL-8 Luc. h-CLAT misst die Erhöhung der Expression der Oberflächenmarker CD54 und CD86 in einer humanen Monozytenzelllinie (THP-1) unter Verwendung der Durchflusszytometrie [Zitat:4][Zitat:10].

Der wichtigste Punkt, den wir bei der Durchführung von h-CLAT in unserem Labor berücksichtigen, ist, dass negative Ergebnisse für Substanzen mit Log P > 3.5 eine geringe Zuverlässigkeit haben [Zitat:12]. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich lipophile Substanzen im Zellkulturmedium nicht ausreichend lösen. Ein Wirkstoff in einem Pestizid (mit einem Log P-Wert von 4,2) ergab ein negatives Ergebnis in der h-CLAT; Wir haben dieses Ergebnis jedoch nicht allein als "kein Sensibilisator" interpretiert. Die Ergebnisse von DPRA und KeratinoSensTM wurden ebenfalls im Rahmen von 2o3 DA berücksichtigt, und da beide positiv waren, wurde das Endergebnis als "Sensibilisator" gemeldet. Dies ist ein konkretes Beispiel dafür, warum h-CLAT nicht isoliert verwendet werden sollte.

Die nachstehende Tabelle enthält eine vergleichende Zusammenfassung der wichtigsten Merkmale der OECD-Leitlinien TG 442C, 442D und 442E.

2o3 Definierter Ansatz: Integrierte Interpretation von drei Tests

2o3 zielt darauf ab, das Hautsensibilisierungspotenzial ohne den Einsatz von Tieren zu bestimmen, indem die Ergebnisse von DA, DPRA, KeratinoSensTM und h-CLAT kombiniert werden. Im Rahmen dieses Ansatzes, der gemäß OECD TG 497 akzeptiert wird, lautet die Grundregel wie folgt: Wenn mindestens zwei der drei Tests positiv sind, wird die Substanz als "Sensibilisator" eingestuft; wenn mindestens zwei negativ sind, wird sie als "kein Sensibilisator" eingestuft. Wenn jedoch eines der Ergebnisse in den "unbestimmten" Bereich fällt oder wenn die Einschränkungen der Tests ins Spiel kommen, kann das DA-Ergebnis "unbestimmt" sein [Zitat:12].

Bei der Anwendung des 2o3 DA in unserem Labor berichten wir die Ergebnisse jedes Tests separat und präsentieren das endgültige DA-Ergebnis zusammen mit unserer Begründung. Zum Beispiel war für ein kosmetisches Konservierungsmittel die DPRA positiv, die KeratinoSensTM positiv und die h-CLAT fiel in den unbestimmten Bereich. Die beiden positiven Ergebnisse waren ausreichend für die DA zu dem Schluss, dass die Substanz ein "Sensibilisator" war, obwohl das h-CLAT-Ergebnis unbestimmt war. Wir haben den Kunden darüber informiert, dass dieser Stoff als GHS-Kategorie 1 eingestuft werden muss und dass der Hinweis "Kann eine allergische Hautreaktion auslösen" auf dem Etikett verwendet werden muss.

Der größte Vorteil des 2o3 DA ist, dass er die Verwendung von Tieren vollständig eliminiert und von den Regulierungsbehörden akzeptiert wird. Unsere Felderfahrung zeigt jedoch, dass die korrekte Interpretation der "zweideutigen" Ergebnisse von DA entscheidend ist. Nach britischen REACH-Daten für einige Stoffe, in vitro Tests haben sich als unzureichend erwiesen, was zu einer Rückkehr zu Tierversuchen führt; Die Hauptgründe sind Löslichkeitsprobleme, UVCB-Substanzen und Unverträglichkeit mit Testsystemen [Zitat: 5]. Aus diesem Grund bewertet unser Labor die physikochemischen Eigenschaften der Testsubstanz vor jeder Studie gründlich und überprüft vorab die Anwendbarkeit des 2o3 DA.

Anwendung der 2o3 DA und Feldbeobachtungen in unserem Labor

In unserem GLP-zertifizierten Labor bieten wir integrierte Tests unter dem 2o3 DA Framework für Tests an, die von den OECD TG 442C, 442D und 442E abgedeckt werden. Unser Testprozess beginnt mit einer umfassenden vorläufigen Bewertung: Löslichkeit, Lipophilie (Log P), chemische Klasse und mögliche Interferenzen der Testsubstanz werden untersucht. Anhand dieser Informationen wird über die Anwendbarkeit des 2o3 DA entschieden.

Zu den Substanzen, die wir in den letzten zwei Jahren mit dem 2o3 DA bewertet haben, gehören kosmetische Konservierungsstoffe, Pflanzenextrakte, Wirkstoffe in Pestiziden und Medizinprodukteextrakte. Die häufigste Herausforderung, vor der wir stehen, ist das Testen komplexer Mischungen wie Pflanzenextrakte. Tests wie DPRA und KeratinoSensTM liefern nur begrenzte Informationen für komplexe Gemische; in solchen Fällen ist der geeignetste Ansatz, die Ergebnisse als "unbestimmt" zu melden und dem Kunden zusätzliche Informationen zu empfehlen (z. B. chemische Charakterisierung oder in silico Modellierung.

Eine weitere Beobachtung aus dem Feld ist die Schwierigkeit, 2o3 DA auf Extrakte aus medizinischen Geräten anzuwenden. Die Norm ISO 10993-10:2021 für Medizinprodukte spezifiziert GPMT, Bühler oder LLNA für die Sensibilisierungsbewertung; 2o3 DA ist jedoch aufgrund der Komplexität von Geräteextrakten möglicherweise nicht immer geeignet. In solchen Fällen arbeiten wir mit dem Kunden zusammen, um die am besten geeignete Teststrategie zu ermitteln und bei Bedarf auch die in vivo Testoption.

Häufig Gestellte Fragen

Eine der häufigsten Fragen, die wir in Bezug auf OECD TG 442C, 442D und 442E erhalten, ist, ob 2o3 DA allein ausreichend ist. Die Antwort hängt von den Eigenschaften der Prüfsubstanz ab. Bei Stoffen mit guter Löslichkeit ist im Allgemeinen kein Metallgehalt und ein Log-P-Wert unter 3,5, 2o3 DA ausreichend. Bei Stoffen mit Löslichkeitsproblemen, UVCB-Stoffen oder komplexen Gemischen kann DA jedoch ein "unbestimmtes" Ergebnis liefern; in diesen Fällen sind zusätzliche Informationen erforderlich.

In Bezug auf die Testdauer beträgt die Gesamtdauer der drei Tests im Allgemeinen 3-4 Wochen (einschließlich Berichterstattung). Die DPRA dauert 1 Woche, KeratinoSensTM dauert 2 Wochen und h-CLAT dauert 2-3 Wochen; Da die Tests jedoch parallel durchgeführt werden können, wird die Gesamtdauer reduziert. Welcher Test für welche Substanz geeignet ist, liefert die DPRA speziell Informationen für Substanzen mit hoher Proteinreaktivität, KeratinoSensTM für Substanzen mit Keratinozytenaktivierung und h-CLAT für Substanzen mit dem Potenzial, dendritische Zellen zu aktivieren. Sie sollten jedoch nicht isoliert, sondern als Teil des 2o3 DA verwendet werden.

Bei der Bewertung der Hautsensibilisierung ist der 2o3 DA ein moderner Ansatz, der den Einsatz von Tieren eliminiert und von den Aufsichtsbehörden anerkannt wird. Mit unseren Tests nach den Standards OECD TG 442C, 442D und 442E bewerten wir das Sensibilisierungspotenzial Ihrer Produkte nach höchsten wissenschaftlichen Standards. Unser GLP-zertifiziertes Labor mit seinen validierten Testsystemen, seinem erfahrenen Personal und seinem Fachwissen vor Ort ist Ihr zuverlässiger Partner für die Prüfung der Hautsensibilisierung. Um das Sensibilisierungsprofil Ihres Produkts zu demonstrieren, kontaktieren Sie uns.