OCDE TG 442C / 442D / 442E: Expérience sur le terrain avec 2o3 DA et des alternatives in vitro dans la sensibilisation cutanée

L'évaluation de la sensibilisation cutanée est un élément indispensable de la sécurité des produits dans les industries des cosmétiques, des produits pharmaceutiques, des pesticides et des dispositifs médicaux. Traditionnellement, cette évaluation a été effectuée à l'aide d'essais sur des modèles animaux (LLNA, GPMT, Buehler); toutefois, conformément aux principes 3R et aux progrès scientifiques, validés. en chimie et in vitro les méthodes ont pris la première place. Au centre de cette transformation est OCDE TG 442C (DPRA), OCDE TG 442D (KeratinoSensTM) et OCDE TG 442E (h-CLAT), avec le 2o3 Approche définie qui combine ces trois tests.

Une partie importante des études de sensibilisation de la peau que nous avons menées dans notre laboratoire au cours des deux dernières années a impliqué ces trois en chimie/in vitro méthodes. En particulier, l'interdiction complète des essais sur les animaux prévue par le règlement de l'UE sur les cosmétiques a rendu ces essais obligatoires pour les fabricants. Cependant, notre expérience sur le terrain montre que les trois tests ont leurs propres forces et faiblesses, et que le 2o3 DA ne donne des résultats fiables que lorsqu'ils sont correctement interprétés.

TG 442C de l'OCDE (DPRA) : mesure chimique de la liaison protéique

OCDE TG 442C est un en chimie test ciblant le premier événement clé (KE1) de la sensibilisation de la peau AOP. Les substances sensibilisantes sont généralement électrophiles dans la nature et forment des liaisons covalentes avec les parties nucléophiles des protéines cutanées (résidus de cystéine et de lysine). DPRA utilise des peptides synthétiques (contenant de la cystéine et de la lysine) pour modéliser cette réaction et mesure la diminution de la concentration de peptides par la CLHP après incubation avec la substance d'essai [citation:1][citation:2].

La solubilité de la substance d'essai est le problème le plus courant que nous rencontrons dans l'exécution de la DPRA en laboratoire. Le protocole précise que la substance d'essai doit être soluble à une concentration de 100 mM; toutefois, cela n'est pas toujours possible avec des échantillons lipophiles ou ceux contenant des particules. Dans une évaluation effectuée dans le cadre du programme REACH du Royaume-Uni, il a été signalé que certaines substances n'avaient pas pu être testées dans le RMRA en raison de l'absence d'un solvant approprié, et cette situation a entraîné un retour à l'expérimentation animale [citation:5]. Notre solution consiste à déclarer le résultat comme « indéterminé » pour les substances à faible solubilité et à les évaluer conjointement avec les autres composants de 2o3 DA. De plus, la RMRA ne convient pas aux composés métalliques et aux substances présentant des propriétés oxydantes; cette limitation est clairement énoncée dans nos rapports [citation:8].

L'avantage le plus important de la RMRA est qu'elle est rapide et rentable; toutefois, elle ne suffit pas à elle seule pour déterminer le potentiel de sensibilisation. Par conséquent, il est utilisé comme source d'information au sein de la DA 2o3.

OCDE TG 442D (KeratinoSensTM): Mesure de l'activation des kératinocytes

OCDE TG 442D est un in vitro test ciblant le deuxième événement clé (KE2) de l'AOP. KeratinoSensTM est une lignée cellulaire de reporter créée en transfectant la lignée cellulaire de kératinocytes humains (HaCaT) avec le gène de la luciférase. Après une exposition de 48 heures à la substance d'essai, l'activation de la voie Nrf2-ARE est mesurée par induction de la luciférase [citation:3][citation:15].

Dans notre expérience sur le terrain, KeratinoSensTM a démontré une grande précision, notamment avec les matières premières cosmétiques. Cependant, un cas a retenu notre attention : Dans un échantillon d'extrait de plante, le résultat KeratinoSensTM est tombé dans la plage « indéterminé » (valeur maximale entre 1,35 et 1,67 fois). Selon les lignes directrices de 2o3 DA, dans ce cas, les deux autres tests (DPRA et h-CLAT) doivent être cohérents et très fiables [citation:12]. Le test RMRA était négatif, alors que le test h-CLAT était positif; en raison de cette incohérence, le résultat de l'AD de 2o3 a été déclaré « indéterminé ». Nous avons informé le client que le potentiel de sensibilisation de cet extrait ne pouvait être définitivement classé et que des renseignements supplémentaires (p. ex. caractérisation chimique ou dans le silico La modélisation) était nécessaire. Ce cas démontre à quel point il est essentiel d'interpréter correctement les résultats « indéterminés » pour 2o3 DA.

OCDE TG 442E (h-CLAT): Mesure de l'activation des cellules dendritiques

OCDE TG 442E couvre in vitro tests ciblant le troisième événement clé (KE3) de l'AOP. Trois méthodes sont définies dans cette ligne directrice : h-CLAT, U-SENSTM et IL-8 Luc. h-CLAT mesure l'augmentation de l'expression des marqueurs de surface CD54 et CD86 dans une lignée de cellules monocytes humaines (THP-1) en utilisant la cytométrie en flux [citation:4][citation:10].

Le point le plus important que nous considérons lors de l'exécution de l'h-CLAT dans notre laboratoire est que les résultats négatifs pour les substances avec un Log P > 3.5 ont une faible fiabilité [citation:12]. Ceci est dû à des substances lipophiles qui ne se dissolvent pas suffisamment dans le milieu de culture cellulaire. Un ingrédient actif d'un pesticide (d'une valeur Log P de 4,2) a donné un résultat négatif dans l'h-CLAT; toutefois, nous n'avons pas interprété ce résultat comme « non sensibilisant ». Les résultats de RMRA et de KeratinoSensMC ont également été examinés dans le cadre de l'AD de 2o3 et, comme les deux résultats étaient positifs, le résultat final a été déclaré comme « sensibilisant ». C'est un exemple concret de la raison pour laquelle h-CLAT ne devrait pas être utilisé isolément.

Le tableau ci-dessous présente un résumé comparatif des principales caractéristiques des lignes directrices de l'OCDE sur les TG 442C, 442D et 442E.

2o3 Approche définie : Interprétation intégrée de trois essais

2o3 vise à déterminer le potentiel de sensibilisation de la peau sans l'utilisation d'animaux en combinant les résultats DA, RMRA, KeratinoSensTM et h-CLAT. Selon cette approche, acceptée dans le cadre du GT 497 de l'OCDE, la règle de base est la suivante : Si au moins deux des trois tests sont positifs, la substance est classée comme « sensibilisant »; si au moins deux sont négatifs, elle est classée comme « non sensibilisant ». Cependant, si l'un des résultats se situe dans la plage « indéterminé » ou si les limites des tests entrent en jeu, le résultat de l'AD peut être « indéterminé » [citation:12].

Lors de l'application de l'AD 2o3 dans notre laboratoire, nous signalons séparément les résultats de chaque test et présentons le résultat final de l'AD avec notre justification. Par exemple, pour un conservateur cosmétique, le DPRA était positif, le KeratinoSensTM était positif et l'h-CLAT était dans la plage indéterminée. Les deux résultats positifs étaient suffisants pour permettre à l'AD de conclure que la substance était un « sensibilisant », même si le résultat de l'h-CLAT était indéterminé. Nous avons informé le client que cette substance doit être classée dans la catégorie 1 du SGH et que l'énoncé « Peut provoquer une réaction cutanée allergique » doit être utilisé sur l'étiquette.

L'avantage le plus important de la 2o3 DA est qu'elle élimine complètement l'utilisation des animaux et est acceptée par les autorités réglementaires. Cependant, notre expérience sur le terrain montre que l'interprétation correcte des résultats « ambitieux » du DA est essentielle. Selon les données REACH du Royaume-Uni, pour certaines substances, in vitro les essais se sont révélés insuffisants, ce qui a entraîné un retour aux essais chez l'animal; les principales raisons sont les problèmes de solubilité, les substances UVCB et l'incompatibilité avec les systèmes d'essai [citation:5]. Pour cette raison, notre laboratoire évalue soigneusement les propriétés physicochimiques de la substance d'essai avant chaque étude et vérifie l'applicabilité du 2o3 DA à l'avance.

Application des 2o3 DA et des observations sur le terrain dans notre laboratoire

Dans notre laboratoire certifié GLP, nous proposons des tests intégrés dans le cadre 2o3 DA pour les tests couverts par les TG 442C, 442D et 442E de l'OCDE. Notre processus d'essai commence par une évaluation préliminaire complète : la solubilité de la substance d'essai, la lipophilite (Log P), la classe chimique et les interférences potentielles sont examinées. Sur la base de cette information, une décision est prise concernant l'applicabilité de la DA 2o3.

Les substances que nous avons évaluées au cours des deux dernières années en utilisant le 2o3 DA comprennent les agents de conservation cosmétiques, les extraits végétaux, les ingrédients actifs des pesticides et les extraits d'instruments médicaux. Le défi le plus fréquent est l'essai de mélanges complexes, comme les extraits végétaux. Les tests tels que le RMRA et le KeratinoSensMC fournissent peu d'information sur les mélanges complexes; dans de tels cas, l'approche la plus appropriée consiste à déclarer les résultats comme étant « indéterminés » et à recommander des renseignements supplémentaires au client (p. ex., caractérisation chimique ou dans le silico la modélisation).

Une autre observation du domaine est la difficulté d'appliquer 2o3 DA à des extraits de dispositifs médicaux. La norme ISO 10993-10:2021 pour les dispositifs médicaux spécifie GPMT, Buehler, ou LLNA pour l'évaluation de la sensibilisation; cependant, 2o3 DA peut ne pas toujours être adapté en raison de la complexité des extraits de dispositifs. Dans de tels cas, nous travaillons avec le client pour déterminer la stratégie d'essai la plus appropriée et, au besoin, évaluer les in vivo option de test.

Foire Aux Questions

L'une des questions les plus courantes que nous recevons au sujet des TG 442C, 442D et 442E de l'OCDE est de savoir si 2o3 DA suffit. La réponse dépend des caractéristiques de la substance d'essai. Pour les substances ayant une bonne solubilité, aucune teneur en métal et une valeur Log P inférieure à 3,5, 2o3 DA est généralement suffisante. Toutefois, pour les substances ayant des problèmes de solubilité, les substances UVCB ou les mélanges complexes, la DA peut donner un résultat « indéterminé »; dans ce cas, des renseignements supplémentaires sont requis.

En ce qui concerne la durée du test, la durée totale des trois tests est généralement de 3 à 4 semaines (y compris la déclaration). La DPRA prend 1 semaine, KeratinoSensTM prend 2 semaines, et h-CLAT prend 2–3 semaines; cependant, puisque les tests peuvent être effectués en parallèle, la durée totale est réduite. Quant à la substance pour laquelle le test convient, le RMRA fournit des informations spécifiques pour les substances à haute réactivité protéique, KeratinoSensMC pour les substances à activation kératinocytaire et h-CLAT pour les substances à potentiel d'activation des cellules dendritiques. Cependant, ils ne devraient pas être utilisés isolément, mais plutôt dans le cadre de la 2o3 DA.

Dans le cadre de l'évaluation de la sensibilisation de la peau, la DA 2o3 est une approche moderne qui élimine l'utilisation des animaux et est reconnue par les autorités réglementaires. Avec nos tests entièrement conformes aux normes OCDE TG 442C, 442D et 442E, nous évaluons le potentiel de sensibilisation de vos produits selon les normes scientifiques les plus élevées. Notre laboratoire certifié GLP, avec ses systèmes de test validés, son personnel expérimenté et son expertise sur le terrain, est votre partenaire fiable pour les besoins de tests de sensibilisation de la peau. Pour démontrer votre profil de sensibilisation, contactez-nous.