Testing de citotoxicidad: demostrando la seguridad de los dispositivos médicos a nivel celular

El primer paso más crítico en la evaluación de biocompatibilidad de los dispositivos médicos es determinar si el dispositivo tiene un efecto tóxico en las células. La prueba de citotoxicidad determina si un dispositivo médico o material es seguro a nivel celular evaluando sus efectos sobre la viabilidad celular, la capacidad de proliferación y la morfología celular. Esta prueba se lleva a cabo de conformidad con ISO 10993-5 estándar y constituye una de las piedras angulares de la evaluación de la biocompatibilidad. Nuestro laboratorio realiza pruebas de citotoxicidad in vitro utilizando métodos tales como MTT, NRU y XTT, así como técnicas de contacto directo y sobrecapa de agar, de acuerdo con los principios GLP y GMP.

La base científica e importancia del examen de la citotoxicidad

La citotoxicidad se refiere a la totalidad de los efectos tóxicos que una sustancia o material ejerce sobre las células. Estos efectos pueden manifestarse como muerte celular (necrosis o apoptosis), daño de la membrana celular, disminución de la actividad metabólica, detención de la proliferación celular y cambios morfológicos. La prueba de citotoxicidad permite la medición cuantitativa o cualitativa de estos efectos in vitro. La ventaja más importante de la prueba es que no requiere el uso de animales y proporciona resultados rápidos, rentables y reproducibles.

La prueba de citotoxicidad se considera el primer paso en la evaluación de la biocompatibilidad. Si un dispositivo es citotóxico, las pruebas adicionales (sensibilización, irritación, implantación) son generalmente innecesarias; porque la citotoxicidad es evidencia de que el dispositivo muestra una incompatibilidad grave a nivel celular. Por lo tanto, la prueba de citotoxicidad es una prueba de detección crítica tanto para la seguridad del paciente como para el uso eficiente de los recursos del fabricante.

Los resultados de la prueba de citotoxicidad se utilizan directamente en la preparación del dossier de biocompatibilidad del dispositivo, en presentaciones regulatorias (EU MDR 2017/745, FDA 510(k), ISO 10993-1), y en la evaluación de seguridad del dispositivo antes del uso clínico. Además, la evaluación del potencial citotóxico de materias primas, aditivos, agentes de liberación de moldes y residuos de esterilización utilizados en el proceso de fabricación del dispositivo se considera un indicador de calidad de producción.

Métodos de alcance y prueba de la norma ISO 10993-5

ISO 10993-5 es la norma fundamental internacionalmente reconocida para in vitro evaluación de la citotoxicidad de los dispositivos médicos. Este estándar proporciona la evaluación de los efectos citotóxicos mediante la aplicación de extractos obtenidos del dispositivo o el material del dispositivo directamente a las culturas celulares. Tres enfoques básicos de prueba se definen dentro del alcance de la norma: el método de extracción, el método de contacto directo, y el método agar overlay (difusión de agar).

Método de Extracción implica la aplicación de extractos preparados del dispositivo de acuerdo con ISO 10993-12 a culturas celulares. Este método es ideal para evaluar el potencial citotóxico de los componentes solubles del dispositivo. Los extractos se preparan utilizando disolventes polares (medios que contienen suero) y no polares (aceite vegetal); por lo tanto, se evalúan los componentes hidrosolubles y lipofílicos. Las temperaturas y duración de la extracción se determinan para reflejar el escenario de uso clínico del dispositivo.

El método de contacto directo implica colocar el material del dispositivo directamente en la cultura celular. Este método es particularmente adecuado para dispositivos sólidos y materiales superficiales, ya que evalúa directamente los efectos resultantes del contacto físico del dispositivo con las células. El material de prueba se coloca en la parte superior del monocapa celular, y la viabilidad celular y morfología se evalúan después de un período de incubación especificado. El método de contacto directo es valioso para evaluar las propiedades superficiales del dispositivo y los efectos locales en el área de contacto.

El método agar overlay (difusión de agar) se realiza por verter una capa de agar sobre una cultura celular y colocar el material del dispositivo en la parte superior de esta capa. Este método permite que las sustancias solubles liberadas del dispositivo difundan a través de la capa de agar y lleguen a las células. La superposición de agar es particularmente adecuada para dispositivos con superficies irregulares o aquellos que contienen partículas; también evita daños mecánicos que podrían resultar de contacto físico directo entre el dispositivo y las células.

Métodos de medición de viabilidad celular: MTT, NRU y XTT

Varios métodos colorimétricos se utilizan para medir la viabilidad celular en los ensayos de citotoxicidad. Estos métodos determinan indirectamente el número de células vivas midiendo la actividad metabólica celular o la integridad de la membrana. Los tres métodos más utilizados son MTT, NRU y XTT.

El ensayo MTT se basa en el principio de que la sal de tetrazolium MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) se reduce por enzimas mitocondriales deshidrogenasa en células para formar cristales de formazán de color púrpura. Los cristales formazan producidos en células vivas se disuelven en un solvente adecuado (DMSO o isopropanol) y miden espectrofotométricamente. El valor de absorción es directamente proporcional al número de células vivas. El ensayo MTT es un método rápido, económico y ampliamente utilizado.

El ensayo NRU (Neutral Red Uptake) se basa en la capacidad de las células vivas para acumular el tinte rojo neutro en sus lisosomas. Las células vivas ocupan activamente el rojo neutro y lo almacenan en sus lisosomas; las células muertas, sin embargo, no pueden soportar este tinte. El tinte se extrae con una solución de alcohol ácido y mide espectrofotométricamente. El ensayo NRU se utiliza específicamente para evaluar la integridad de la membrana y la función lisosomal; puede proporcionar resultados más estables en comparación con el ensayo MTT.

El ensayo XTT se basa en el principio de la reducción de XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide), una sal de tetrazolio similar a la utilizada en el ensayo MTT, por células. La ventaja más importante de XTT es que forma un producto formazán soluble en agua; por lo tanto, el paso de disolución requerido en el ensayo MTT no es necesario. El ensayo XTT es más rápido y requiere menos pasos; también muestra menor citotoxicidad en comparación con el ensayo MTT.

En el cuadro que figura a continuación se resumen los métodos de prueba y las técnicas de medición de viabilidad celular utilizados en la norma ISO 10993-5.

Evaluación y Clasificación de Resultados de Citotoxicidad

Los resultados de la prueba de citotoxicidad se evalúan según los criterios definidos en ISO 10993-5. El porcentaje de viabilidad celular se calcula comparando con el control negativo. La clasificación generalmente aceptada es la siguiente: Si la viabilidad celular es superior al 70%, el material se considera "no citotóxico". Si la viabilidad celular es entre 50 y 70 por ciento, el material se clasifica como "mildly citotóxico"; en este caso, se pueden requerir pruebas o optimización adicionales. Si la viabilidad celular es inferior al 50 por ciento, el material se clasifica como "significativamente citotóxico", y se concluye que el dispositivo no es adecuado para uso clínico.

La evaluación morfológica es un complemento importante de las mediciones numéricas. La forma, tamaño, granulación citoplasmática, integridad de la membrana y las uniones intercelulares de las células se evalúan bajo un microscopio. Por ejemplo, redondeo celular, retracción citoplasmática, vacuolización y desapego de la capa celular son indicadores morfológicos de la citotoxicidad. Estas observaciones se interpretan conjuntamente con datos cuantitativos para llegar a una decisión final.

Los resultados de la prueba de citotoxicidad son un componente clave del informe de biocompatibilidad que se utilizará en la presentación regulatoria del dispositivo. Si el dispositivo no es citotóxico, las pruebas pueden proceder a otras pruebas de biocompatibilidad (sensibilización, irritación, implantación). Si el dispositivo es citotóxico, el fabricante debe revisar la composición material, el proceso de producción o el método de esterilización. En este caso, nuestro laboratorio ofrece consultas científicas al fabricante sobre materiales alternativos, revestimientos o pasos de descontaminación.

Realización de pruebas de citotoxicidad en nuestro laboratorio

En nuestro laboratorio certificado GLP y GMP, realizamos pruebas de citotoxicidad de acuerdo con ISO 10993-5, en pleno cumplimiento de las normas internacionales. Nuestro proceso de prueba comienza con una evaluación preliminar completa. La composición material del dispositivo, el proceso de fabricación, el método de esterilización y el escenario de uso clínico se examinan detalladamente. Basado en esta información, se determina el método de prueba más adecuado (extracción, contacto directo o sobrecapa de agar) y técnica de medición de viabilidad celular (MTT, NRU o XTT).

El proceso de extracción se realiza de acuerdo con ISO 10993-12. Utilizando volúmenes específicos de disolventes polares (medio de cultivo que contiene suero) y no polares (aceite vegetal) por área de superficie o masa del dispositivo, la extracción se realiza a temperaturas y durante duraciónes que reflejan el uso clínico. Los extractos polares y no polares se prueban por separado. Las culturas celulares se preparan usando líneas celulares reconocidas internacionalmente ( fibroblastos de ratón L-929, BALB/3T3, V79 o fibroblastos de piel humana). Las células se propagan bajo condiciones adecuadas de medio cultural y de incubación (37°C, 5% CO2).

Después de que el material de prueba o el extracto se aplica a las células, se incuba por un período específico (normalmente 24–72 horas). Al final de la incubación, la viabilidad celular se mide utilizando el ensayo MTT, NRU o XTT. Los resultados se interpretan comparando con controles negativos y positivos. El polietileno de alta densidad (HDPE) o vidrio de alta pureza se utiliza como el control negativo, mientras que las soluciones que contienen organotina (dibutiltin dilaurate) o fenol se utilizan como el control positivo. Estos controles son críticos para verificar la sensibilidad del sistema de prueba.

Una de las ventajas clave de nuestro laboratorio es que ofrecemos estrategias de prueba personalizadas para diferentes tipos de dispositivos. Para dispositivos de forma líquida (geles, cremas, soluciones), se utiliza la aplicación directa; para dispositivos sólidos, se utiliza contacto directo o extracción; para materiales que contienen partículas, se utiliza la superposición de agar; y para dispositivos con superficies irregulares se utilizan protocolos de extracción modificados. Esta flexibilidad garantiza que las características únicas de cada dispositivo sean debidamente evaluadas.

Test results are presented in a comprehensive test report format compliant with ISO 10993-5. The report includes sections on the test method, cell line, extraction conditions, cell viability data, morphological observations, statistical analyses, and interpretation. Our reports meet the requirements of the EU MDR (2017/745), FDA 510(k), ISO 10993-1, and other regulatory frameworks.

Preguntas Frecuentes

One of the most common questions we receive regarding cytotoxicity testing is which test method is suitable for which device. The choice depends on the device’s physical form and clinical usage scenario. For liquid and gel-based devices, extraction or direct application may be appropriate; for solid devices, direct contact or extraction; and for materials containing particles, agar overlay may be suitable. Our laboratory evaluates the characteristics of your device to recommend the most appropriate method.

The difference between MTT, NRU, and XTT assays is also frequently asked. MTT measures mitochondrial activity and requires the dissolution of formazan crystals. NRU assesses lysosomal function and provides information on membrane integrity. XTT, on the other hand, is faster and requires fewer steps because it produces a water-soluble formazan product. The choice of method depends on the device’s characteristics and the laboratory’s preference; however, all methods are validated and internationally recognized.

Regarding the test duration, the total time—including cell culture preparation, extraction, incubation, and measurement steps—is generally 2–4 weeks. Including reporting and quality assurance reviews, this period may extend to 4–6 weeks. As for which devices are subject to cytotoxicity testing, the answer is that, in accordance with ISO 10993-1, a cytotoxicity assessment is mandatory for all medical devices that come into contact with the skin, mucous membranes, blood, or tissue. This is the first and most fundamental step in biocompatibility assessment.

Finally, there is often curiosity about what should be done if a device is found to be “cytotoxic” as a result of cytotoxicity testing. In this case, the manufacturer must review the material composition, the manufacturing process (mold release agents, solvents, additives), and the sterilization method. Our laboratory offers advanced analytical methods—such as extraction fractionation, chemical analysis, and alternative material testing—to identify the source of the problem. The goal is to ensure the device’s safety and compliance with regulatory requirements.

A cytotoxicity test provides scientific evidence of your medical device’s safety at the cellular level. A rigorous cytotoxicity study conducted in accordance with ISO 10993-5:2009 forms the foundation of your device’s biocompatibility profile and represents the first critical step in the regulatory approval process. Our laboratory evaluates your device’s cellular compatibility to the highest scientific standards using MTT, NRU, and XTT methods, as well as direct contact and agar overlay techniques. To be your trusted partner on your medical device’s biocompatibility journey, contact us.