اختبار السمية السيوتوية: تحديد سلامة الأجهزة الطبية على المستوى الخليوي

وتتمثل الخطوة الأولى والأكثر أهمية في تقييم التوافق البيولوجي للأجهزة الطبية في تحديد ما إذا كان للجهاز تأثير سام على الخلايا. اختبار السمية يحدد ما إذا كان الجهاز الطبي أو المواد الطبية مأمونة على مستوى الخلايا بتقييم آثارها على قدرة الخلايا على البقاء، وعلى القدرة على الانتشار، وعلى المورفولوجيا الخلوية. ويجرى هذا الاختبار وفقاً للاختبار ISO 10993-5 (ب) المعيار ويشكل أحد أركان تقييم التوافق البيولوجي. مختبرنا يقوم باختبارات السمية in vitro (ج) استخدام أساليب مثل MTT, NRU, and XTT، فضلاً عن تقنيات الاتصال المباشر ونفقات السكر، وفقاً لمبادئ GLP و GMP.

The Scientific Basis and Importance of the Cytotoxicity Test

وتشير السمية إلى مجموع الآثار السامة التي تحدثها المادة أو المواد على الخلايا. ويمكن أن تتجلى هذه الآثار في وفاة الخلايا (التكسير أو السكتة السكانية)، والضرر الناجم عن الغشاء الخلوي، وانخفاض النشاط الأيضي، وتوقيف انتشار الخلايا، والتغيرات الوبائية. The cytotoxicity test enables the quantitative or qualitative measurement of these effects in vitroوالميزة الأهم للاختبار هي أنه لا يتطلب استخدام الحيوانات ويوفر نتائج سريعة وفعالة من حيث التكلفة ومنتجة.

The cytotoxicity test is considered the first step in biocompatibility assessment. وإذا كان الجهاز سميّاً، فإن إجراء المزيد من الاختبارات (التحسس، الغضب، الزرع) أمر غير ضروري عموماً؛ لأن السمية المغلقة هي دليل على أن الجهاز يظهر عدم تطابق خطير على مستوى الخلايا. ومن ثم، فإن اختبار السمية المغلقة هو اختبار فحص حرج لسلامة المرضى وللاستخدام الفعال لموارد الصانع.

وتستخدم نتائج اختبار السمية السيطوية مباشرة في إعداد ملف المطابقة الأحيائية للجهاز، في التقارير التنظيمية (EU MDR 2017/745, FDA 510(k), ISO 10993-1) وفي تقييم سلامة الجهاز قبل الاستخدام السريري. وعلاوة على ذلك، يُعتبر تقييم قدرة المواد الخام والمواد المضافة وعوامل إطلاق العفن وبقايا التعقيم المستخدمة في عملية صنع الأجهزة مؤشراً لنوعية الإنتاج.

نطاق المعيار ISO 10993-5 وطرائق الاختبار

ISO 10993-5 هو المعيار الأساسي المعترف به دوليا in vitro cytotoxicity evaluation of medical devices. وينص هذا المعيار على تقييم آثار السمية السباتية من خلال تطبيق مقتطفات تم الحصول عليها من الجهاز أو مواد الجهاز نفسه مباشرة على ثقافات الخلايا. وتُعرَّف ثلاثة نُهُج اختبار أساسية في نطاق المعيار، وهي: طريقة الاستخراج، وطريقة الاتصال المباشر، وطريقة النفقة المفرطة للسكر (النشرة الضئيلة).

طريقة الاستخراج يشمل تطبيق المقتطفات المعدة من الجهاز وفقاً للمنظمة الدولية لتوحيد المقاييس 10993-12 على ثقافات الخلايا. وهذه الطريقة مثالية لتقييم الإمكانات السامة للمكونات القابلة للذوبان في الجهاز. ويجري إعداد مقتطفات باستخدام المذيبات القطبية (المتوسطة المحتوية على طبول) وغير القطبية (النفط النباتي)؛ ومن ثم، يتم تقييم كل من المكوّنات العازلة المائية والليبوبية. وقد صممت درجات الحرارة ومدة الاستخراج على أن تعكس سيناريو الاستخدام السريري للجهاز.

طريقة الاتصال المباشر يتضمّن وضع مواد الجهاز مباشرة على ثقافة الخلية. وهذه الطريقة مناسبة بصفة خاصة للأجهزة الصلبة والمواد السطحية، لأنها تقي ِّم مباشرة الآثار الناجمة عن الاتصال المادي للجهاز بالخلايا. وتوضع مواد الاختبار على رأس المبيد الخلوي، وتُقيَّم صلاحية الخلايا والمورفولوجيا بعد فترة احتضان محددة. وأسلوب الاتصال المباشر له قيمة في تقييم الممتلكات السطحية للجهاز والآثار المحلية في مجال الاتصال.

The agar overlay (agar diffusion) method يُؤدّي بصب طبقة من الأغار على ثقافة خلية ووضع مواد الجهاز فوق هذه الطبعة This method allows soluble substances released from the tool to diffuse through the agar layer and reach the cells. كما أن الإفراط في الإغارة مناسب بشكل خاص للأجهزة ذات السطح غير النظامي أو التي تحتوي على جزيئات؛ كما أنه يمنع الضرر الميكانيكي الذي يمكن أن ينجم عن اتصال جسدي مباشر بين الجهاز والخلايا.

Cell Viability Measurement Methods: MTT, NRU, and XTT

وتُستخدم أساليب متماثلة مختلفة لقياس قدرة الخلايا على البقاء في مؤخرات السمية. These methods indirectly determine the number of live cells by measuring cellular metabolic activity or membrane integrity. The three most commonly used methods are MTT, NRU, and XTT.

The MTT assay ويقوم على المبدأ القائل بأن ملح التترازوليوم MTT tetrazolium (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltrazoliumبروميد) يُخفض بواسطة إنزيمات mitochondrial dehydrogenase في الخلايا لتشكيل بلورات شكلية من النوع الأرجواني. وتُحل البلورات الشكلية المنتجة في الخلايا الحية في مذيب مناسب (DMSO أو isopropanol) وتُقاس بصورة متماثلة. وتتناسب قيمة الامتصاص بشكل مباشر مع عدد الخلايا الحية. The MTT assay is a fast, economical, and widely used method.

The NRU (Neutral Red Uptake) assay يقوم على قدرة الخلايا الحية على تجميع الصبغة الحمراء المحايدة في سمهم وتأخذ الخلايا الحية على نحو نشط حمراء محايدة وتخزنها في سباتهم؛ غير أن الخلايا الميتة لا يمكن أن تلتقط هذا الصبغ. The dye is extracted with an acidic alcohol solution and measured spectrophotometrically. The NRU assay is used specifically to assess membrane integrity and lysomal function; it may provide more stable results compared to the MTT assay.

The XTT assay ويستند هذا المبدأ إلى مبدأ الحد من نمور التاميل (XTT) (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)، وهو ملح من التيترازوليوم مماثل للملح المستخدم في مقذوفات MTT، حسب الخلايا. The most significant advantage of XTT is that it forms a water-soluble formazan product; therefore, the dissolution step required in the MTT assay is not necessary. The XTT assay is faster and requires fewer steps; it also exhibits lower cytotoxicity compared to the MTT assay.

ويوجز الجدول أدناه أساليب الاختبار وتقنيات قياس قدرة الخلايا المستخدمة في المعيار ISO 10993-5.

تقييم وتصنيف نتائج السمية

وتُقيَّم نتائج اختبار السمية السيطوية وفقاً للمعايير المحددة في المعيار ISO 10993-5. وتحسب النسبة المئوية لصلاحية الخلايا بالمقارنة مع الرقابة السلبية. وفيما يلي التصنيف المقبول عموما: إذا كانت قدرة الخلايا أعلى من 70 بالمائة، المادة تعتبر "غير سمية". وإذا كانت صلاحية الخلايا تتراوح بين 50 و70 في المائة، فإن المادة تصنف على أنها " سمية ملحة " ؛ وفي هذه الحالة، قد يلزم إجراء اختبارات إضافية أو الاستفادة المثلى. إذا كانت قدرة الخلايا أقل من 50 بالمائة، فإن المادة تصنف على أنها سمية ساوثة بشكل كبير، ويستنتج أن الجهاز غير مناسب للاستخدام السريري.

والتقييم الافتراضي مكمل هام للقياسات العددية. ويجري تقييم شكل الخلايا، وحجمها، وضمها، ونزاهتها، وموجات الخلايا المتقاطعة في إطار مجهر. وعلى سبيل المثال، فإن تقريب الخلايا، واستخلاص السايتوبلازما، والتخدير، وفصل طبقة الخلايا، هي مؤشرات لعلم السموم. وتفسر هذه الملاحظات بالاقتران مع البيانات الكمية للتوصل إلى قرار نهائي.

وتمثل نتائج اختبار السمية السيطوية عنصرا رئيسيا من عناصر تقرير التوافق البيولوجي الذي سيستخدم في العرض التنظيمي للجهاز. وإذا لم يكن الجهاز سمياً، يمكن للاختبار أن يمضي إلى اختبارات أخرى للتوافق البيولوجي (التحسس، الغضب، الزرع). وإذا كان الجهاز سمياً، يجب على الصانع أن يستعرض التركيبة المادية أو عملية الإنتاج أو طريقة التعقيم. وفي هذه الحالة، يقدم مختبرنا مشاورة علمية إلى الصانع فيما يتعلق بالمواد البديلة أو المعاطف أو خطوات إزالة التلوث.

إجراء اختبارات للسمية في مختبرنا

ونجري في مختبرنا المصدق عليه من نظام GLP و GMP اختبارات للسمية وفقا للمعيار ISO 10993-5، مع الامتثال التام للمعايير الدولية. وتبدأ عملية اختبارنا بتقييم أولي شامل. ويدرس بالتفصيل التركيب المادي للجهاز، وعملية التصنيع، وطريقة التعقيم، والسيناريو الخاص بالاستخدام السريري. واستناداً إلى هذه المعلومات، يتم تحديد أنسب طريقة للاختبار (الخلاص، أو الاتصال المباشر، أو النفقة المفرطة للسكر) وتقنية قياس قدرة الخلايا على البقاء (MTT، أو NRU، أو XTT).

وتُجرى عملية الاستخراج وفقاً للمنظمة الدولية لتوحيد المقاييس 10993-12. وباستخدام أحجام محددة من المذيبات القطبية (الثقافة المحتوية على الاسطوانات) وغير القطبية (النفط النباتي) لكل منطقة سطح الوحدة أو كتلة من الجهاز، يتم استخراجها بدرجات حرارة ومدة تعكس الاستخدام السريري. ويجري اختبار المقتطفات القطبية وغير القطبية بصورة منفصلة. وتعد ثقافات الخلايا باستخدام خطوط الخلايا المعترف بها دولياً (L-929 الألياف الفموية، BALB/3T3، V79، أو ألياف الجلد البشرية). وتُنشر الخلايا في ظروف ثقافية ومتوسطة ومحتضنة (37 درجة مئوية، 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون).

وبعد تطبيق مواد الاختبار أو الاستخراج على الخلايا، يتم احتضانها لفترة محددة )من ٢٤ إلى ٢٧ ساعة تقريبا(. At the end of incubation, cell viable is measured using the MTT, NRU, or XTT assay. وتفسر النتائج بمقارنتها بالضوابط السلبية والإيجابية. ويستخدم البوليثيلين العالي الكثافة أو الكثافة العالية النقاء كالمراقبة السلبية، في حين تستخدم الحلول التي تحتوي على العضوي (ديبولتين ديلورات) أو الفينول كمكافحة إيجابية. وتتسم هذه الضوابط بأهمية حاسمة للتحقق من حساسية نظام الاختبار.

ومن مزايا مختبرنا الرئيسية أننا نقدم استراتيجيات اختبار مصممة خصيصا لمختلف أنواع الأجهزة. وفيما يتعلق بأجهزة الاستنشاق بالسائل (الجيلات والكريمات والحلول)، يُستخدم التطبيق المباشر؛ وبالنسبة للأجهزة الصلبة، يُستخدم الاتصال المباشر أو الاستخراج؛ وبالنسبة للمواد التي تحتوي على الجسيمات، يُستخدم الإفراط بالسكر؛ وبالنسبة للأجهزة ذات السطح غير النظامي، تستخدم بروتوكولات الاستخراج المعدلة. وتكفل هذه المرونة إجراء تقييم سليم للخصائص الفريدة لكل جهاز.

Test results are presented in a comprehensive test report format compliant with ISO 10993-5. The report includes sections on the test method, cell line, extraction conditions, cell viability data, morphological observations, statistical analyses, and interpretation. Our reports meet the requirements of the EU MDR (2017/745), FDA 510(k), ISO 10993-1, and other regulatory frameworks.

الأسئلة الشائعة

One of the most common questions we receive regarding cytotoxicity testing is which test method is suitable for which device. The choice depends on the device’s physical form and clinical usage scenario. For liquid and gel-based devices, extraction or direct application may be appropriate; for solid devices, direct contact or extraction; and for materials containing particles, agar overlay may be suitable. Our laboratory evaluates the characteristics of your device to recommend the most appropriate method.

The difference between MTT, NRU, and XTT assays is also frequently asked. MTT measures mitochondrial activity and requires the dissolution of formazan crystals. NRU assesses lysosomal function and provides information on membrane integrity. XTT, on the other hand, is faster and requires fewer steps because it produces a water-soluble formazan product. The choice of method depends on the device’s characteristics and the laboratory’s preference; however, all methods are validated and internationally recognized.

Regarding the test duration, the total time—including cell culture preparation, extraction, incubation, and measurement steps—is generally 2–4 weeks. Including reporting and quality assurance reviews, this period may extend to 4–6 weeks. As for which devices are subject to cytotoxicity testing, the answer is that, in accordance with ISO 10993-1, a cytotoxicity assessment is mandatory for all medical devices that come into contact with the skin, mucous membranes, blood, or tissue. This is the first and most fundamental step in biocompatibility assessment.

Finally, there is often curiosity about what should be done if a device is found to be “cytotoxic” as a result of cytotoxicity testing. In this case, the manufacturer must review the material composition, the manufacturing process (mold release agents, solvents, additives), and the sterilization method. Our laboratory offers advanced analytical methods—such as extraction fractionation, chemical analysis, and alternative material testing—to identify the source of the problem. The goal is to ensure the device’s safety and compliance with regulatory requirements.

A cytotoxicity test provides scientific evidence of your medical device’s safety at the cellular level. A rigorous cytotoxicity study conducted in accordance with ISO 10993-5:2009 forms the foundation of your device’s biocompatibility profile and represents the first critical step in the regulatory approval process. Our laboratory evaluates your device’s cellular compatibility to the highest scientific standards using MTT, NRU, and XTT methods, as well as direct contact and agar overlay techniques. To be your trusted partner on your medical device’s biocompatibility journey, contact us.