Тестирование на цитотоксичность: демонстрация безопасности медицинских устройств на клеточном уровне

Первым и наиболее важным шагом в оценке биосовместимости медицинских устройств является определение того, оказывает ли устройство токсическое воздействие на клетки. Тест на цитотоксичность определяет, является ли медицинское устройство или материал безопасным на клеточном уровне, оценивая его влияние на жизнеспособность клеток, пролиферационную способность и клеточную морфологию. Это испытание проводится в соответствии с ISO 10993-5 Стандарт является одним из краеугольных камней оценки биосовместимости. Наша лаборатория проводит тесты на цитотоксичность in vitro использование методов, таких как MTT, NRU и XTT, а также методов прямого контакта и наложения агара, в соответствии с принципами GLP и GMP.

Научная основа и значение теста на цитотоксичность

Цитотоксичность относится к совокупности токсических эффектов, которые вещество или материал оказывают на клетки. Эти эффекты могут проявляться как гибель клеток (некроз или апоптоз), повреждение клеточной мембраны, снижение метаболической активности, остановка пролиферации клеток и морфологические изменения. Тест на цитотоксичность позволяет количественно или качественно измерить эти эффекты. in vitroНаиболее значительным преимуществом теста является то, что он не требует использования животных и обеспечивает быстрые, экономически эффективные и воспроизводимые результаты.

Тест на цитотоксичность считается первым шагом в оценке биосовместимости. Если устройство является цитотоксическим, дальнейшее тестирование (сенсибилизация, раздражение, имплантация) обычно не требуется, поскольку цитотоксичность является доказательством того, что устройство демонстрирует серьезную несовместимость на клеточном уровне. Таким образом, тест на цитотоксичность является критическим скрининговым тестом как для безопасности пациента, так и для эффективного использования ресурсов производителя.

Результаты теста на цитотоксичность непосредственно используются при подготовке досье биосовместимости устройства в нормативных документах (EU MDR 2017/745, FDA 510(k), ISO 10993-1) и при оценке безопасности устройства до клинического использования. Кроме того, оценка цитотоксического потенциала сырья, добавок, агентов высвобождения плесени и остатков стерилизации, используемых в производственном процессе устройства, считается показателем качества продукции.

Сфера применения и методы испытаний стандарта ISO 10993-5

ISO 10993-5 является международно признанным основополагающим стандартом для in vitro Оценка цитотоксичности медицинских изделий. Настоящий стандарт предусматривает оценку цитотоксических эффектов путем нанесения экстрактов, полученных из устройства или самого материала устройства, непосредственно на клеточные культуры. В рамках стандарта определены три основных подхода к испытаниям: метод экстракции, метод прямого контакта и метод наложения агара (диффузия агара).

Метод экстракции включает применение экстрактов, полученных из устройства в соответствии с ISO 10993-12, к клеточным культурам. Этот метод идеально подходит для оценки цитотоксического потенциала растворимых компонентов устройства. Экстракты получают с использованием полярных (содержащих сыворотку среды) и неполярных (растительного масла) растворителей; таким образом, оцениваются как водорастворимые, так и липофильные компоненты. Температура и продолжительность экстракции определяются с учетом клинического сценария использования устройства.

Метод прямого контакта Он включает в себя размещение материала устройства непосредственно на клеточной культуре. Этот метод особенно подходит для твердых устройств и поверхностных материалов, поскольку он непосредственно оценивает эффекты, возникающие в результате физического контакта устройства с клетками. Испытательный материал помещают поверх монослоя клетки, а жизнеспособность и морфология клеток оцениваются после заданного инкубационного периода. Метод прямого контакта является ценным для оценки свойств поверхности устройства и локальных эффектов в зоне контакта.

Метод наложения агара (agar diffusion) выполняется путем наливания слоя агара на культуру клетки и размещения материала устройства поверх этого слоя. Этот метод позволяет растворимым веществам, высвобождаемым из устройства, диффундировать через слой агара и достигать клеток. Наложение агара особенно подходит для устройств с нерегулярными поверхностями или с частицами; оно также предотвращает механические повреждения, которые могут возникнуть в результате прямого физического контакта между устройством и клетками.

Методы измерения жизнеспособности клеток: MTT, NRU и XTT

Различные колориметрические методы используются для измерения жизнеспособности клеток в анализах цитотоксичности. Эти методы косвенно определяют количество живых клеток путем измерения клеточной метаболической активности или целостности мембраны. Три наиболее часто используемых метода - MTT, NRU и XTT.

Анализ MTT основан на принципе, что соль тетразолия МТТ (3-(4,5-диметилтиазола-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида) уменьшается ферментами митохондриальной дегидрогеназы в клетках с образованием кристаллов формазана фиолетового цвета. Кристаллы формазана, полученные в живых клетках, растворяются в подходящем растворителе (DMSO или изопропанол) и измеряются спектрофотометрически. Значение поглощения прямо пропорционально количеству живых клеток. Анализ MTT является быстрым, экономичным и широко используемым методом.

NRU (нейтральное красное поглощение) Он основан на способности живых клеток накапливать нейтральный красный краситель в своих лизосомах. Живые клетки активно поглощают нейтральный красный цвет и хранят его в своих лизосомах; мертвые клетки, однако, не могут поглощать этот краситель. Краситель экстрагируют кислотным спиртовым раствором и измеряют спектрофотометрически. Анализ NRU используется специально для оценки целостности мембраны и лизосомальной функции; он может обеспечить более стабильные результаты по сравнению с анализом MTT.

Анализ XTT основан на принципе восстановления XTT (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолия-5-карбоксанилида), тетразолиевой соли, аналогичной той, которая используется в анализе MTT, клетками. Наиболее значительным преимуществом XTT является то, что он образует водорастворимый продукт формазана, поэтому этап растворения, требуемый в анализе MTT, не является необходимым. Анализ XTT быстрее и требует меньше шагов; он также демонстрирует более низкую цитотоксичность по сравнению с анализом MTT.

В приведенной ниже таблице приведены методы испытаний и методы измерения жизнеспособности клеток, используемые в соответствии с ISO 10993-5.

Оценка и классификация результатов цитотоксичности

Cytotoxicity test results are evaluated according to the criteria defined in ISO 10993-5. The percentage of cell viability is calculated by comparison with the negative control. The generally accepted classification is as follows: If cell viability is above 70 percent, the material is considered “non-cytotoxic.” If cell viability is between 50 and 70 percent, the material is classified as “mildly cytotoxic”; in this case, additional testing or optimization may be required. If cell viability is below 50 percent, the material is classified as “significantly cytotoxic,” and it is concluded that the device is not suitable for clinical use.

Morphological evaluation is an important complement to numerical measurements. The shape, size, cytoplasmic granulation, membrane integrity, and intercellular junctions of the cells are evaluated under a microscope. For example, cell rounding, cytoplasmic retraction, vacuolization, and detachment of the cell layer are morphological indicators of cytotoxicity. These observations are interpreted in conjunction with quantitative data to reach a final decision.

Cytotoxicity test results are a key component of the biocompatibility report to be used in the device’s regulatory submission. If the device is not cytotoxic, testing can proceed to other biocompatibility tests (sensitization, irritation, implantation). If the device is cytotoxic, the manufacturer must review the material composition, production process, or sterilization method. In this case, our laboratory provides scientific consultation to the manufacturer regarding alternative materials, coatings, or decontamination steps.

Conducting Cytotoxicity Tests in Our Laboratory

In our GLP- and GMP-certified laboratory, we conduct cytotoxicity tests in accordance with ISO 10993-5, in full compliance with international standards. Our testing process begins with a comprehensive preliminary evaluation. The device’s material composition, manufacturing process, sterilization method, and clinical usage scenario are examined in detail. Based on this information, the most appropriate test method (extraction, direct contact, or agar overlay) and cell viability measurement technique (MTT, NRU, or XTT) are determined.

The extraction process is performed in accordance with ISO 10993-12. Using specific volumes of polar (serum-containing culture medium) and non-polar (vegetable oil) solvents per unit surface area or mass of the device, extraction is carried out at temperatures and for durations that reflect clinical use. Polar and non-polar extracts are tested separately. Cell cultures are prepared using internationally recognized cell lines (L-929 mouse fibroblasts, BALB/3T3, V79, or human skin fibroblasts). Cells are propagated under appropriate culture medium and incubation conditions (37°C, 5% CO₂).

After the test material or extract is applied to the cells, it is incubated for a specific period (typically 24–72 hours). At the end of incubation, cell viability is measured using the MTT, NRU, or XTT assay. The results are interpreted by comparing them to negative and positive controls. High-density polyethylene (HDPE) or high-purity glass is used as the negative control, while solutions containing organotin (dibutyltin dilaurate) or phenol are used as the positive control. These controls are critical for verifying the sensitivity of the test system.

One of our laboratory’s key advantages is that we offer customized testing strategies for different device types. For liquid-form devices (gels, creams, solutions), direct application is used; for solid devices, direct contact or extraction is used; for materials containing particles, agar overlay is used; and for devices with irregular surfaces, modified extraction protocols are used. This flexibility ensures that the unique characteristics of each device are properly evaluated.

Test results are presented in a comprehensive test report format compliant with ISO 10993-5. The report includes sections on the test method, cell line, extraction conditions, cell viability data, morphological observations, statistical analyses, and interpretation. Our reports meet the requirements of the EU MDR (2017/745), FDA 510(k), ISO 10993-1, and other regulatory frameworks.

Часто Задаваемые Вопросы

One of the most common questions we receive regarding cytotoxicity testing is which test method is suitable for which device. The choice depends on the device’s physical form and clinical usage scenario. For liquid and gel-based devices, extraction or direct application may be appropriate; for solid devices, direct contact or extraction; and for materials containing particles, agar overlay may be suitable. Our laboratory evaluates the characteristics of your device to recommend the most appropriate method.

The difference between MTT, NRU, and XTT assays is also frequently asked. MTT measures mitochondrial activity and requires the dissolution of formazan crystals. NRU assesses lysosomal function and provides information on membrane integrity. XTT, on the other hand, is faster and requires fewer steps because it produces a water-soluble formazan product. The choice of method depends on the device’s characteristics and the laboratory’s preference; however, all methods are validated and internationally recognized.

Regarding the test duration, the total time—including cell culture preparation, extraction, incubation, and measurement steps—is generally 2–4 weeks. Including reporting and quality assurance reviews, this period may extend to 4–6 weeks. As for which devices are subject to cytotoxicity testing, the answer is that, in accordance with ISO 10993-1, a cytotoxicity assessment is mandatory for all medical devices that come into contact with the skin, mucous membranes, blood, or tissue. This is the first and most fundamental step in biocompatibility assessment.

Finally, there is often curiosity about what should be done if a device is found to be “cytotoxic” as a result of cytotoxicity testing. In this case, the manufacturer must review the material composition, the manufacturing process (mold release agents, solvents, additives), and the sterilization method. Our laboratory offers advanced analytical methods—such as extraction fractionation, chemical analysis, and alternative material testing—to identify the source of the problem. The goal is to ensure the device’s safety and compliance with regulatory requirements.

A cytotoxicity test provides scientific evidence of your medical device’s safety at the cellular level. A rigorous cytotoxicity study conducted in accordance with ISO 10993-5:2009 forms the foundation of your device’s biocompatibility profile and represents the first critical step in the regulatory approval process. Our laboratory evaluates your device’s cellular compatibility to the highest scientific standards using MTT, NRU, and XTT methods, as well as direct contact and agar overlay techniques. To be your trusted partner on your medical device’s biocompatibility journey, contact us.