细胞毒性测试:显示细胞一级医疗器械的安全性

医疗器械生物相容性评估的第一个也是最重要的步骤是确定该器械是否对细胞产生毒性影响. 细胞毒性测试 通过评估医疗器械或材料对细胞生存能力、扩散能力和细胞形态的影响,确定其在细胞一级是否安全。 本试验按照下列规定进行: ISO 10993-5号标准 构成生物兼容性评估的基石之一。 我们的实验室进行细胞毒性测试 试管 按照GLP和GMP原则,使用MTT、NRU和XTT等方法,以及直接接触和agar上覆技术。

毒性试验的科学基础和重要性

毒性是指一种物质或材料对细胞产生的全部毒性影响。 这些影响可能表现为:细胞死亡(坏死或发作),细胞膜损伤,代谢活性减少,细胞增殖被抑制,形态变化. 细胞毒性测试能够对这些效应进行定量或定性测量 试管试验的最大优点是不需要使用动物,并且提供迅速、成本效益高和可复制的结果。

细胞毒性测试被认为是生物兼容性评估的第一步。 如果一个装置具有细胞毒性,则一般没有必要进行进一步测试(敏感性、刺激性、植入性);因为细胞毒性是该装置在细胞层面表现出严重不相容性的证据。 因此,细胞毒性测试是对病人安全和有效利用制造商资源的一项关键筛选测试。

细胞毒性测试结果被直接用于制备该设备的生物相容性档案,用于监管提交(EU MDR 2017/745,FDA 510(k),ISO 10993-1),以及临床使用前该设备的安全评估. 此外,评价原材料、添加剂、模具放出剂以及设备制造过程中使用的消毒残留物的细胞毒性潜力被认为是生产质量的一个指标。

ISO 10993-5标准的范围和试验方法

ISO 10993-5号标准 国际承认的基本标准 试管 医疗器械细胞毒性评价. 本标准规定,通过将从设备或设备材料本身得到的提取物直接应用到细胞培养中来评估细胞毒性效应. 在标准范围内定义了三种基本测试方法:取出法,直接接触法,和agar上覆(agar扩散)法.

采掘方法 涉及将根据ISO 10993-12号标准从设备中制取的提取物应用于细胞培养。 这种方法是评估该装置可溶性部件的细胞毒性潜力的理想方法。 提取物使用极地(含血浆介质)和非极地(植物油)溶剂制备;因此,对可溶于水和脂的成分都进行了评估。 确定取出温度和持续时间是为了反映该装置的临床使用情况。

直接接触方法 涉及将设备材料直接放入细胞培养层。 这种方法特别适用于固体装置和地表材料,因为它直接评价该装置与细胞的物理接触所产生的效果. 试验材料被放入细胞单层的上方,在指定的孵化期后,对细胞的可行性和形态进行评估. 直接接触方法对于评估设备在接触区的表面特性和局部影响很有价值。

Agar 覆盖法( Agar 扩散) 是通过将一层agar倒入细胞培养层并将设备材料放入该层上方来实现的。 这种方法可以使从设备中释放出可溶性物质能通过agar层扩散并到达细胞. Agar上盖特别适合表面不规则或有颗粒的装置;它也防止了装置与细胞之间直接物理接触可能造成的机械损害.

细胞活性测量方法: MTT、NRU和XTT

在细胞毒性测定中,使用了各种测色方法来测量细胞的可行性. 这些方法通过测量细胞代谢活性或膜完整性,间接决定活细胞的数量. 三种最常用的方法是MTT,NRU和XTT.

MTT分析 其原理是 MTT 四zo盐 (3- (4, 5- 二甲基i-2-yl)-2, 5- 二苯基四zo溴)由细胞中的线粒体脱氢酶还原而成紫色的福马赞晶体. 在活细胞中产生的福马赞晶体被溶解入合适的溶剂(DMSO或异丙醇)并被分光测量. 吸收值与活细胞数直接成正比. MTT测定法是一种快捷,经济,广泛使用的方法.

NRU( 新红色取景) 分析 其基础是活细胞能将中性红染料堆积在淋巴质中. 活细胞积极取出中性红色并储存在它们的淋巴上;然而活细胞不能取出这种染料. 染料用酸性醇溶液取出并分光测量. 与MTT测定法相比,NRU测定法专门用来评估膜完整性和淋巴功能;它可能提供更稳定的结果.

XTT 分析 其原理是将XTT(2,3-之二-(2-甲氧基-4-硝基-5-硫苯基)-2H-四zo-5-carboxanilide),一种四zo盐与MTT测定中使用的盐相类似,由细胞分解. XTT最显著的优势是它形成了可溶于水的福马赞产品;因此,MTT测定所需的溶解步骤没有必要. XTT测定速度快,所需步骤也更少;与MTT测定相比,它也表现出较低的细胞毒性.

下表汇总了ISO 10993-5规定的测试方法和细胞可行性测量技术.

毒性结果的评估和分类

根据ISO 10993-5确定的标准,对毒性测试结果进行评估。 与负控相比,计算出细胞存活率的百分比. 公认的分类如下: 如果细胞存活率超过70%,则材料被认为是"无细胞毒性". 如果细胞存活率在50%至70%之间,则该物质被归类为"百万细胞毒性";在这种情况下,可能需要额外的测试或优化. 如果细胞存活率低于50%,则该物质被归类为"显著细胞毒性",并得出结论该装置不适合临床使用.

口感评价是对数值测量的重要补充. 细胞的外形,体积,细胞质颗粒,膜完整性,细胞间接点在显微镜下进行评估. 例如,细胞圆形,细胞质还原,活体分解,细胞层分解是细胞毒性的形态指标. 这些意见与定量数据一并解释,以便作出最后决定。

细胞毒性试验结果是生物相容性报告的一个关键组成部分,将用于该装置的监管材料。 如果该装置没有细胞毒性,测试可以进行其他生物相容性测试(敏化,刺激,植入). 如果设备具有细胞毒性,制造商必须审查材料成分、生产工艺或消毒方法。 在这种情况下,我们的实验室就替代材料、涂层或去污步骤向制造商提供科学咨询。

在我们的实验室进行细胞毒性测试

在我们的GLP和GMP认证实验室,我们完全按照国际标准,根据ISO 10993-5进行细胞毒性测试。 我们的测试过程首先要进行全面的初步评估。 详细审查了该装置的材料组成、制造工艺、绝育方法和临床使用情况。 根据这一信息,确定了最适当的测试方法(取出、直接接触或agar上盖)和细胞可行性测量技术(MTT、NRU或XTT)。

提取过程按照ISO 10993-12进行. 利用单位地表面积或设备质量的极地(含血浆培养介质)和非极地(植物油)溶剂的特定体积,在温度和反映临床用途的持续时间内进行取出. 极地与非极地取出物分别进行试验. 细胞培养用国际公认的细胞线来制备(L-929小鼠纤维管,BALB/3T3,V79,或人皮纤维管. 细胞在适当的培养介质和孵化条件下得到传播(37°C,5%CO2)。

试验材料或提取物被应用到细胞后,被孵化一段时间(一般为24-72小时). 孵化后,用MTT,NRU或XTT测定法来测量细胞的可行性. 对结果的解释是将它们与消极和积极的控制相比较。 高密度聚乙烯(HDPE)或高纯度玻璃被作为负控制剂,而含有有机锡(二丁基二甲酸酯)或酚的溶液被作为正控制剂. 这些控制对于验证测试系统的敏感性至关重要.

我们实验室的主要优势之一是 我们对不同的设备类型提供定制测试策略。 对于液态装置(凝胶,奶油,溶液),直接应用;对于固态装置,直接接触或取出;对于含有颗粒的材料,使用agar上覆;对于表面不规则的装置,使用修改的取出协议. 这种灵活性确保每个设备的独特性得到适当的评价。

测试结果采用符合ISO 10993-5的综合测试报告格式。 报告包括测试方法、细胞线、提取条件、细胞生存能力数据、形态观测、统计分析和解释等部分。 我们的报告符合欧盟MDR(2017/745)、FDA 510(k)、ISO 10993-1和其他监管框架的要求。

常见问题

我们收到的关于细胞毒性测试的最常见问题之一是哪种测试方法适合于哪种设备。 选择取决于设备的物理形式和临床用途。 对于以液体和凝胶为基础的装置,提取或直接施用可能是适当的;对于固态装置,直接接触或取出;对于含有颗粒的材料,涂上醋可能是适当的。 我们的实验室评估你设备的特性 推荐最合适的方法

MTT、NRU和XTT化验的区别也经常被问及。 MTT测量线粒体活性,需要分解福玛赞晶体. NRU评估淋巴功能,并提供有关膜完整性的信息. 另一方面,XTT更快,所需步骤也更少,因为它生产出可溶于水的福马赞产品. 方法的选择取决于设备的特性和实验室的偏好;然而,所有方法都得到验证和国际公认的。

关于试验时间,总时间—包括细胞培养准备、提取、孵化和测量步骤—一般为2至4周。 包括报告和质量保证审查,这一期限可延长至4至6周。 至于哪些设备需要进行细胞毒性测试,答案是,根据ISO 10993-1,所有接触皮肤、粘膜、血液或组织的医疗设备都必须进行细胞毒性评估。 这是生物相容性评估的第一个也是最基本的步骤.

最后,由于细胞毒性测试的结果,如果发现一个装置"细胞毒性",人们往往对应该做什么感到好奇. 在这种情况下,制造商必须审查材料成分、制造工艺(出厂剂、溶剂、添加剂)和消毒方法。 我们的实验室提供先进的分析方法—如提取分解、化学分析和替代材料测试—找出问题的根源。 目标是确保装置的安全并遵守管制要求。

细胞毒性测试为您的医疗器械在细胞层面的安全提供了科学证据。 根据ISO 10993-5:2009进行的严格细胞毒性研究,构成你设备生物相容性剖面的基础,是监管审批程序的第一个关键步骤。 我们的实验室使用 MTT、NRU和XTT 方法, 以及直接接触和护甲上覆技术, 来评估您的设备的细胞兼容性, 与我们联系。