Aktuelle Ansätze zur Bewertung der Hautsensibilisierung: OECD TG 406, TG 429 und ISO 10993-10:2021
Allergische Kontaktdermatitis ist eine immunvermittelte Hypersensibilitätsreaktion des verzögerten Typs, die sich als Reaktion auf Chemikalien und medizinische Geräte entwickelt. Die Bestimmung des Potenzials einer Substanz, eine Hautsensibilisierung (Allergie) zu verursachen, ist ein entscheidender Schritt in der Sicherheitsbewertung von Chemikalien, kosmetischen Inhaltsstoffen, Pestiziden, Biozidprodukten und medizinischen Geräten. Die Sensibilisierung unterscheidet sich von anderen Arten lokaler Toxizität aufgrund von Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Immungedächtnis; Eine Person, die sensibilisiert wurde, kann sogar bei einer erneuten Exposition gegenüber sehr niedrigen Konzentrationen eine schwere Reaktion entwickeln. Daher ist die Auswahl der geeigneten Prüfmethode sowohl für die Einhaltung der Vorschriften als auch für die Sicherheit der Anwender von entscheidender Bedeutung. Unser Labor hält sich an die drei grundlegenden internationalen Standards in diesem Bereich — OECD TG 406 (GPMT/Buehler) OECD TG 429 (LLNA) und ISO 10993-10:2021 — in Übereinstimmung mit den GLP- und GMP-Grundsätzen unter Verwendung der aktuellsten wissenschaftlichen Ansätze.
OECD TG 406: Traditionelle In-vivo-Sensibilisierungstests – GPMT- und Bühler-Methoden
OECD TG 406 ist ein Klassiker in vivo Testleitlinie zur Bewertung des Hautsensibilisierungspotenzials chemischer Substanzen. In dieser Richtlinie sind zwei verschiedene Methoden definiert: Meerschweinchen-Maximierungstest (GPMT) und BühlertestBeide Methoden verwenden das Meerschweinchenmodell, und das Grundprinzip besteht darin, die allergische Reaktion durch eine Provokationsanwendung nach einem bestimmten Zeitraum nach der Induktionsphase mit der Testsubstanz zu bewerten.
Der GPMT ist eine hochsensible Methode, die ein Adjuvans (Freund’s Complete Adjuvans – FCA) verwendet, um das Immunsystem zu stärken, wodurch auch Substanzen mit geringem Sensibilisierungspotenzial nachgewiesen werden können. Die Induktion wird durch eine Kombination aus intradermaler Injektion und topischer Anwendung erreicht. Der Buehler-Test, auf der anderen Seite, verwendet kein Adjuvans; Induktion wird ausschließlich durch topische Anwendung durchgeführt. Daher modelliert der Bühler-Test Szenarien für die Exposition des Menschen realistischer, weist jedoch eine geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu GPMT auf. Während der Bühler-Test für topische Medikamente und kosmetische Inhaltsstoffe bevorzugt wird, eignet sich der GPMT eher für Industriechemikalien und Pestizide. Bei beiden Methoden wird die Bewertung durch die Einstufung von Hautreaktionen (Erythema und Ödem) 24 und 48 Stunden nach der Herausforderung durchgeführt.
OECD TG 429: Local Lymph Node Assay (LLNA) – Ein moderner und quantitativer Ansatz
OECD TG 429 ist eine moderne Alternative mit einem Mausmodell, das signifikante Vorteile gegenüber Meerschweinchentests bei der Beurteilung der Hautsensibilisierung bietet. Der lokale Lymphknoten-Assay (LLNA) ist die erste validierte in vivo Eine Methode, die die Induktionsphase der Sensibilisierung misst und die Ergebnisse quantitativ ausdrückt. Grundprinzip des Tests ist die topische Applikation der Prüfsubstanz auf die Haut des Mausohrs, gefolgt von der Messung der Lymphozytenproliferation in regionalen (aurikulären) Lymphknoten unter Verwendung von radioaktiv markiertem Thymidin (3H-Methylthymidin).
Die wichtigsten Vorteile des LLNA gegenüber den GPMT- und Bühler-Verfahren sind folgende:
- Quantitatives Ergebnis Das Sensibilisierungspotential wird durch Berechnung des Stimulationsindex (SI) numerisch ausgedrückt.
- EC3-Wert: Die effektive Konzentration der Testsubstanz, die 3% Stimulation bewirkt, kann berechnet werden; dieser Wert ermöglicht eine vergleichende Bewertung des Sensibilisierungspotenzials.
- Weniger Tiere und kürzere Dauer: Während die GPMT 20-30 Meerschweinchen und 4-6 Wochen benötigt, benötigt der LLNA nur 16-20 Mäuse und 1-2 Wochen.
- 3R-Konformität: Der LLNA passt besser zu den Prinzipien der Reduktion (weniger Tiere) und der Verfeinerung (weniger invasive Verfahren).
- Objektive Bewertung: Da es auf Radioaktivitätsmessung und nicht auf visueller Bewertung basiert, werden subjektive Urteile minimiert.
Die OECD empfiehlt derzeit den LLNA (TG 429) als primäres Verfahren zur Beurteilung der Hautsensibilisierung gegenüber chemischen Stoffen; Meerschweinchentests (TG 406) werden als Backup-Verfahren nur für spezifische Fälle angesetzt, in denen der LLNA nicht angewendet werden kann.
ISO 10993-10:2021: Bewertung der Hautsensibilisierung für Medizinprodukte
ISO 10993-10:2021 ist die internationale Norm, die Hautsensibilisierungstests im Rahmen der Biokompatibilitätsbewertung für Medizinprodukte definiert. Diese Norm umfasst Testmethoden, bei denen Extrakte aus dem Produkt oder dem Produktmaterial selbst verwendet werden, um das Potenzial für allergische Kontaktdermatitis durch Medizinprodukte und Biomaterialien zu bewerten. Die ISO 10993-10 ist eine umfassende Norm, die nicht nur Sensibilisierungs-, sondern auch Hautreizungstests abdeckt; mit der Überarbeitung 2021 wurden diese beiden Bewertungsbereiche detailliert behandelt.
Für die Beurteilung der Hautsensibilisierung gemäß ISO 10993-10:2021 werden drei Hauptmethoden empfohlen:
- Meerschweinchen-Maximierungstest (GPMT): Bevorzugt in Situationen, die eine hohe Empfindlichkeit erfordern; besonders geeignet für dauerhafte Implantate und Geräte mit längerem Hautkontakt.
- Bühler-Test (Closed Patch Test): Ein adjuvantfreies Verfahren mit topischer Anwendung zur Induktion; besonders geeignet für Oberflächengeräte und Produkte mit Kurzzeitkontakt.
- Lokaler Lymphknotentest (LLNA): Eine quantitative Alternative unter Verwendung eines Mausmodells; offiziell anerkannt für Medizinprodukte gemäß ISO 10993-10:2021.
Der bedeutendste Unterschied zwischen ISO 10993-10:2021 und früheren Versionen ist die Annahme eines risikobasierten Ansatzes für die Auswahl der Prüfmethoden und ihre Bezugnahme auf in vitro/ in der Chemie alternative Methoden (z. B. Methoden, die unter die OECD-Prüfungen TG 442C, TG 442D und TG 442E fallen). Die Norm besagt, dass in bestimmten Fällen eine Sensibilisierungsbewertung ohne Tierversuche durchgeführt werden kann, basierend auf chemischen Charakterisierungsdaten und vorhandener Literatur.
Die folgende Tabelle zeigt eine vergleichende Analyse der drei Hauptleitlinien:
| Funktion | OECD TG 406 — GPMT | OECD TG 406 — Bühler | OECD TG 429 — LLNA | ISO 10993-10:2021 |
|---|---|---|---|---|
| Prüfsystem | Meerschweinchen (Hartley oder Dunkin-Hartley) | Meerschweinchen (Hartley oder Dunkin-Hartley) | Maus (CBA/Ca oder C57BL/6) | Meerschweinchen oder -maus (mit Produktextrakt/-material) |
| Verwendung von Adjuvans | Ja (Freund’s Complete Adjuvant – FCA) | Nein | Nein (kein Adjuvans erforderlich) | Methodenabhängig (ja in GPMT, nein in Bühler, nein in LLNA) |
| Induktionsweg | Intradermale Injektion + topische Anwendung | Nur topische Anwendung (okklusives Pflaster) | Topische Anwendung (Ohrhaut) | Anwendung des Produktextrakts oder -materials über einen geeigneten Weg |
| Prüfdauer | 4–6 Wochen | 4–6 Wochen | 1–2 Wochen | Abhängig von der Methode (1-6 Wochen) |
| Anzahl der Tiere | 20–30 (Test + Kontrolle) | 20–30 (Test + Kontrolle) | 16–20 (Test + Kontrolle) | Abhängig von der Methode (16-30) |
| Ergebnisart | Qualitativ (positiv/negativ), Bewertung der Hautreaktion | Qualitativ (positiv/negativ), Bewertung der Hautreaktion | Quantitativ (SI – Stimulationsindex, EC3-Wert) | Qualitativ oder quantitativ (methodenabhängig) |
| Bewertungszeit | 24 und 48 Stunden nach der Challenge | 24 und 48 Stunden nach der Challenge | 5 Tage nach der letzten Applikation (Lymphknotenanalyse) | methodenabhängig |
| 3R Einhaltung der Vorschriften | Low-Medium | Mittel | Hoch (Reduktion und Verfeinerung) | Mittelhoch (mit Option LLNA) |
| Regulatorische Verwendung | REACH, CLP, EPA FIFRA, Pestizide und Biozidprodukte | Topische Drogen, kosmetische Inhaltsstoffe | REACH, CLP, EPA – empfohlen als primäre Methode | EU MDR (2017/745), ISO 10993-1, FDA 510(k), Biokompatibilität von Medizinprodukten |
| Empfindlichkeit | Hoch (erkennt auch schwache Sensibilisatoren) | Moderat (bessere Modelle für die Exposition des Menschen) | Hoch (vergleichbar mit GPMT) | methodenabhängig |
Leitfaden für die Auswahl der Prüfmethode
Die folgende Tabelle hilft Ihnen bei der Auswahl des geeigneten Hautsensibilisierungstests basierend auf Ihrem Produkttyp und Ihrem regulatorischen Ziel:
| Produktart/Anforderung | Empfohlene Methode | Begründung |
|---|---|---|
| Industriechemikalien, Pestizide, Biozidprodukte (unter REACH/CLP) | OECD TG 429 (LLNA) | OECD-Primärmethode; quantitative Daten (EC3), weniger Tiere, kürzere Dauer, ideal für REACH. |
| Topische Arzneimittelformulierung, kosmetischer Inhaltsstoff (Nicht-EU-Vorschriften) | OECD TG 406 (Buehler) | Die topische Anwendung ohne Adjuvans modelliert realistischere Expositionsszenarien für den Menschen. |
| Stoffe, bei denen der Verdacht besteht, dass es sich um schwache Allergene handelt, wenn maximale Empfindlichkeit erforderlich ist | OECD TG 406 (GPMT) | Höchste Nachweiskapazität dank der Verwendung eines Adjuvans; in der Lage, Sensibilisatoren mit geringem Potenzial zu erkennen. |
| Situationen, in denen LLNA nicht angewendet werden kann (z. B. wenn eine radioaktive Markierung nicht möglich ist) | OECD TG 406 (GPMT oder Bühler) | In bestimmten Situationen, in denen LLNA-Alternativen nicht geeignet sind, dienen Meerschweinchentests als Backup-Methode. |
| Medizinisches Gerät – permanentes Implantat, langfristiger Hautkontakt | ISO 10993-10:2021 (GPMT) | Eine hohe Empfindlichkeit bietet die beste Einschätzung des potenziellen Sensibilisierungsrisikos, das von permanenten Geräten ausgeht. |
| Medizinisches Gerät – Oberflächengerät, Kurzzeitkontakt | ISO 10993-10:2021 (Buehler oder LLNA) | Die topische Anwendung bzw. quantitative LLNA-Option reicht für Geräte mit Kurzzeitkontakt aus und ist 3R-konform. |
| Medizinprodukt – verpflichtende Biokompatibilität nach EU-MDR (2017/745) | ISO 10993-10:2021 | Die MDR verweist auf die Reihe ISO 10993 zur Biokompatibilitätsbewertung von Medizinprodukten; der Sensibilisierungstest ist für alle Produkte, die mit der Haut in Berührung kommen, obligatorisch. |
Moderne Alternativen: In Vitro und in Chemico Methoden
Heute gibt es in vitro und in der Chemie Methoden—als Alternativen zu Tierversuchen für die Bewertung der Hautsensibilisierung entwickelt und von der OECD validiert—verfügbar. Unser Labor bietet diese alternativen Methoden als Teil seines Testportfolios an:
| OECD-Leitlinien | Methode | Sensibilisierungsstadium gemessen | Prüfsystem |
|---|---|---|---|
| TG 442C | Direkter Peptidreaktivitätsassay (DPRA) | Schlüsselschritt 1: Proteinbindung (Haptenation) | Chemisch (in der Chemie) – synthetische Peptide |
| TG 442D | KeratinoSensTM / ARE-Nrf2-Luziferaseassay | Schlüsselschritt 2: Keratinozytenaktivierung | In vitro – humane Keratinozyten-Zelllinie |
| TG 442E | h-CLAT / U-SENSTM / IL-8 Luc Assay | Schlüsselschritt 3: Dendritische Zellaktivierung | In vitro – humane Monozyten/dendritische zellähnliche Zelllinien |
Da diese alternativen Methoden nur eine einzige Stufe der Sensibilisierung allein beurteilen können, bieten sie höchste Genauigkeit, wenn sie in Kombination im Rahmen der OECD verwendet werden. Definierter Ansatz (DA)Da Tierversuche in der EU verboten sind, insbesondere für kosmetische Mittel, sind diese in vitro/ in der Chemie Methoden sind die einzige obligatorische Option. Durch die Anwendung dieser modernen Alternativen ist unser Labor in der Lage, Sensibilisierungsbewertungen für kosmetische und Körperpflegeprodukte ohne den Einsatz von Tieren durchzuführen.
Durchführung von Hautsensibilisierungstests in unserem Labor
In unserem GLP- und GMP-zertifizierten Labor führen wir Hautsensibilisierungstests unter vollständiger Einhaltung internationaler Standards durch. Unser erfahrenes Team von Toxikologen und Veterinärpathologen bewertet die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die chemische Struktur und die regulatorischen Anforderungen Ihres Produkts vor jeder Studie, um die am besten geeignete Teststrategie zu empfehlen. Wir haben die Infrastruktur für die radioaktive Kennzeichnung für LLNA und implementieren die GPMT- und Bühler-Tests vollständig. Für Medizinprodukte werden gemäß ISO 10993-10:2021 Tests mit Extrakten durchgeführt, die aus Ihrem Gerät gemäß ISO 10993-12 hergestellt wurden, und die Ergebnisse werden in Ihr Biokompatibilitätsbewertungsdossier integriert. Darüber hinaus durch das Angebot in vitro/in der Chemie Alternativen, die nicht den Einsatz von Tieren erfordern, zeigen wir das größte Engagement für die 3R-Prinzipien.
Häufig Gestellte Fragen
| Frage | Antwort |
|---|---|
| Kann der LLNA immer den GPMT und den Bühler-Test ersetzen? | In den meisten Fällen ja. Die OECD empfiehlt den LLNA als primäre Methode und ordnet Meerschweinchentests nur als Backup für Situationen an, in denen der LLNA nicht angewendet werden kann. Einige Regulierungsbehörden können jedoch die GPMT für bestimmte Produkttypen verlangen. |
| Welcher Sensibilisierungstest ist für kosmetische Mittel obligatorisch? | Nach der EU-Kosmetikverordnung (EC 1223/2009) sind Tierversuche für kosmetische Mittel und deren Inhaltsstoffe vollständig verboten. Daher ist die Verwendung von in vitro/in der Chemie Methoden, die unter die OECD TG 442C, 442D und 442E in Verbindung mit dem Defined Approach (DA) fallen, sind obligatorisch. |
| Unter welchen Umständen ist ein Sensibilisierungstest für Medizinprodukte erforderlich? | Nach ISO 10993-1 ist eine Sensibilisierungsbeurteilung für alle Medizinprodukte erforderlich, die mit der Haut in Berührung kommen. Nach der EU-MDR (2017/745) werden diese Daten im Biokompatibilitätsdossier in Abhängigkeit von der Klasse und Dauer des Kontakts des Geräts benötigt. |
| Kann LLNA nach ISO 10993-10:2021 verwendet werden? | Ja. ISO 10993-10:2021 erkennt GPMT, Bühler und LLNA offiziell für die Sensibilisierung der Haut an. LLNA wird bevorzugt, insbesondere in Fällen, in denen die Einhaltung der 3R-Prinzipien Priorität hat. |
| Wie lange dauert es, um Testergebnisse zu erhalten? | LLNA: 3-4 Wochen (einschließlich Berichterstattung). GPMT/Buehler: 6-8 Wochen (einschließlich Berichterstattung). In vitro Alternativen: 2–3 Wochen. Die Gesamtdauer kann je nach Arbeitsbelastung und Qualitätssicherungsprüfung variieren. |
| Wenn eine Substanz sowohl als chemische als auch als Medizinproduktkomponente bewertet werden soll, welcher Test sollte durchgeführt werden? | Da sich die regulatorischen Kontexte unterscheiden, können beide Bewertungen separat erforderlich sein. Die Prüfung nach OECD TG 429 oder TG 406 ist für die chemische Einstufung geeignet; die Prüfung nach ISO 10993-10:2021 ist für die Biokompatibilität von Medizinprodukten geeignet. Unser Labor bietet integrierte Lösungen, um diese beiden Anforderungen zu erfüllen. |
Die Hautsensibilisierung ist ein toxikologischer Endpunkt, der die Sicherheit der Benutzer direkt beeinflusst und nicht übersehen werden kann. Die genaue Bestimmung des Risikos allergischer Reaktionen mit wissenschaftlichen Methoden ist ein entscheidender Faktor für die Zuverlässigkeit und Marktakzeptanz Ihres Produkts. Unser Labor führt alle Hautsensibilisierungstests gemäß OECD TG 406, OECD TG 429 und ISO 10993-10:2021 nach den GLP-Standards und unter größtmöglicher Einhaltung der 3R-Prinzipien durch. Um mit uns an der Planung der am besten geeigneten Sensibilisierungsstrategie für Ihre chemische Substanz oder Ihr Medizinprodukt zu arbeiten, kontaktieren Sie uns.
