Skin Sensitizasyon Değerlendirmesine Mevcut Yaklaşımlar: OECD TG 406, TG 429 ve ISO 10993-10:2021
Alerjik temas dermatit, kimyasal ve tıbbi cihazlara yanıt veren bağışıklık tipi bir hipersensitivite reaksiyonudur. Bir maddenin cilt duyarlılıklarına (allerji) neden olma potansiyelini belirlemek, kimyasalların, kozmetik maddelerinin, pestisitlerin, biyocidal ürünlerin ve tıbbi cihazların güvenlik değerlendirmesinde kritik bir adımdır. Sensitizasyon, doz-response ilişkileri ve bağışıklık hafızası nedeniyle diğer yerel toksisite türlerinden farklıdır; hoşgörüsüz hale gelen bir kişi, çok düşük konsantrasyonlara yeniden maruz kalabilir. Bu nedenle, uygun test yönteminin seçimi hem düzenleyici uyumluluk hem de kullanıcı güvenliği için hayati öneme sahiptir. Laboratuvarlarımız bu alanda üç temel uluslararası standartlara uyuyor — OECD TG 406 (GPMT/Buehler) OECD TG 429 (LLNA) ve ISO 10993-10-10:2021 — GLP ve GMP ilkelerine uygun olarak, en güncel bilimsel yaklaşımlar kullanarak.
OECD TG 406: Geleneksel In Vivo Sensitizasyon Testleri - GPMT ve Buehler Yöntemleri
OECD TG 406 Klasik bir klasik in vivo Test rehberi, kimyasal maddelerin deri hassasiyet potansiyelini değerlendirmek için kullanılır. Bu kılavuzda iki farklı yöntem tanımlanmıştır: Gine Pig Maximization Test (GPMT) ve Buehler TestHer iki yöntem de guinea pig modelini kullanır ve temel prensip, indüksiyon (sensitizasyon) aşamasını test ile takip eden belirli bir süre sonra alerjik cevabı değerlendirmektir.
GPMT Bir uvant (Freund'un Tamam Adjuvant – FCA) bağışıklık sistemini artırmak için çok hassas bir yöntemdir, böylece düşük hassasiyet potansiyeli olan maddelerin tespitini sağlar. İndüksiyon, intradermal enjeksiyon ve topikal uygulama kombinasyonu ile elde edilir. Buehler TestÖte yandan, sadece topikal uygulama yoluyla indüksiyon yapılır. Bu nedenle, Buehler Test modelleri insan maruz kalma senaryoları daha gerçekçi bir şekilde ancak GPMT ile kıyasla daha düşük hassasiyete sahiptir. Buehler Testi topikal ilaçlar ve kozmetik malzemeler için tercih edilirken, GPMT endüstriyel kimyasallar ve pestisitler için daha uygundur. Her iki yöntemde, değerlendirme cilt reaksiyonları (erithema ve edema) 24 ve 48 saat sonra yapılır.
OECD TG 429: Yerel Lymph Node Assay (LLNA) – Modern ve Quantitative Approach
OECD TG 429 Deri duyarlılık değerlendirmesinde belirgin avantajları sunan bir fare modeli kullanarak modern bir alternatiftir. Yerel Lymph Node Assay (LLNA) İlk doğrulama in vivo Yanlışlaştırmanın indüksiyon aşamasını ölçen yöntem ve sonuçları sayısal olarak ifade eder. Testin temel prensibi, test maddenin topikal uygulamasını fare kulağı derisine içerir, bölgesel (aurüler) lenf düğümlerinin ölçümünü bölgesel olarak (aurüler) lenf düğümlerini radyoaktif olarak etiketleyerek takip eder (3H-til yourmidine).
LLNA'nın GPMT ve Buehler yöntemlerine kıyasla en önemli avantajları şunlardır:
- Sayısal sonuç: Hassasizasyon potansiyeli Stimulation Index (SI) tarafından sayısal olarak ifade edilir.
- EC3 değeri: Test maddenin% 3 uyarıya neden olan etkili konsantrasyonu hesaplanabilir; bu değer, hassasiyet potansiyelinin karşılaştırmalı bir değerlendirmesine izin verir.
- Daha az hayvan ve daha kısa süre: GPMT 20-30 guinea pigleri ve 4-6 haftasını gerektirirken, LLNA sadece 16-20 fare ve 1-2 hafta gerektirir.
- 3R uyumluluğu: LLNA daha iyi azaltılması ilkeleri ile uyum sağlar (feksiyon hayvanları) ve Refinement (daha invaziv olmayan prosedürler).
- Hedef değerlendirme: Görsel skorlamadan ziyade radyoaktivite ölçümlerine dayanıyor olduğundan, öznel yargılar en aza indirgeniyor.
OECD şu anda LLNA'yı (TG 429) kimyasal maddelere deri hassasiyetlerini değerlendirmek için birincil yöntem olarak tavsiye eder; pozisyonları guinea pig testleri (TG 406) sadece LLNA'nın uygulanamayacağı özel durumlar için.
ISO 10993-10:2021: Tıbbi Cihazlar için Skin Sensitizasyon Değerlendirmesi
ISO 10993-10:2021 Tıbbi cihazlar için biyokompatlanabilirlik değerlendirmesi kapsamında uluslararası standart tanımlı deri hassasiyet testleridir. Bu standart, cihazdan elde edilen ekstralar veya cihazın materyalinin tıbbi cihazlar ve biyomalzemeler tarafından önerilen alerjik kontak dermatit potansiyelini değerlendirmek için test yöntemleri içerir. ISO 10993-10 sadece hassasiyetle değil aynı zamanda cilt tahriş testini kapsayan kapsamlı bir standarttır; 2021 revizyonuyla bu iki değerlendirme alanı ayrıntılı olarak ele alındı.
ISO 10993-10 altında cilt duyarlılık değerlendirme için üç birincil yöntem önerilir:2021:
- Gine Pig Maximization Test (GPMT): Yüksek hassasiyet gerektiren durumlarda tercih edilir; özellikle uzun cilt temasını kalıcı implantlar ve cihazlar için uygundur.
- Buehler Test (Kayıtlı Patch Test): İndüksiyon için topikal bir uygulama kullanarak başka bir yöntem; özellikle kısa süreli temasa sahip yüzey cihazları ve ürünler için uygundur.
- Yerel Lymph Node Assay (LLNA): Bir fare modeli kullanarak sayısal bir alternatif; ISO 10993-10:2021 uyarınca tıbbi cihazlar için resmi olarak kabul edildi.
ISO 10993-10 arasında en önemli fark:2021 ve önceki sürümler, yöntem seçimi ve referansını test etmek için risk bazlı bir yaklaşım benimsemesidir. in vitro/ chemico Alternatif yöntemler (örneğin, OECD TG 442C, TG 442D ve TG 442E tarafından ele alınan yöntemler). Standart devletler, belirli durumlarda, bir hassasiyet değerlendirme, kimyasal karakterizasyon verileri ve mevcut literatüre dayanan hayvan testi olmadan tamamlanabilir.
Aşağıdaki tablo üç ana yönergenin karşılaştırmalı bir analizi sunar:
| Özellik | OECD TG 406 – GPMT | OECD TG 406 – Buehler | OECD TG 429 – LLNA | ISO 10993-10:2021 |
|---|---|---|---|---|
| Test Sistemi | Gine domuz (Hartley veya Dunkin-Hartley) | Gine domuz (Hartley veya Dunkin-Hartley) | Mouse (CBA/Ca veya C57BL/6) | Gine domuz veya fare (kullanıcı/malzeme ile) |
| Adjuvant kullanımı | Evet (Freund'un Tamam Adjuvant – FCA) | Hayır | Hayır (yakıya gerek yok) | Yönteme bağlı (Eehler'de değil, LLNA'da) |
| Induction Route | Intradermal enjeksiyon + topikal uygulama | Topical application only (occlusive patch) | Topical application (ear Skin) | Cihazın uygulanması uygun bir rota ile veya malzeme |
| Test süresi | 4-6 hafta | 4-6 hafta | 1–2 hafta | Yönteme bağlı (1-6 hafta) |
| Hayvanların Sayısı | 20-30 (test + kontrol) | 20-30 (test + kontrol) | 16-20 (test + kontrol) | Yönteme bağlı olarak (16-30) |
| Sonuç Tipi | Qualitative (pozitif/negative), deri reaksiyon skoru | Qualitative (pozitif/negative), deri reaksiyon skoru | Quantitative (SI – Stimulation Index, EC3 değeri) | Qualitative veya nicel (method-bağlı) |
| Değerlendirme Zamanı | 24 ve 48 saat sonra zorluk | 24 ve 48 saat sonra zorluk | Son uygulamadan 5 gün sonra (lymph node analysis) | Yöntem bağımsız |
| 3R Compliance | Low-Medium | Orta | Yüksek (Reduction and Refinement) | Medium-High (With LLNA seçeneği) |
| Düzenleme Kullanımı | REACH, CLP, EPA FIFRA, pestisitler ve biyocidal ürünler | Topical ilaçlar, kozmetik malzemeler | REACH, CLP, EPA - birincil yöntem olarak önerilir | EU MDR (2017/745), ISO 10993-1, FDA 510 (k), tıbbi cihaz biyokopatlanabilirliği |
| Hassasiyet | Yüksek (detects even poor senatörs) | Moderate (better modeller insan maruziyeti) | Yüksek ( GPMT için uygun) | Yöntem bağımsız |
Test Yöntemi Seçim Kılavuzu
The table below will help you select the appropriate skin sensitization test based on your product type and regulatory objective:
| Product Type / Requirement | Recommended Method | Orannale |
|---|---|---|
| Industrial chemicals, pesticides, biocidal products (under REACH/CLP) | OECD TG 429 (LLNA) | OECD primary method; quantitative data (EC3), fewer animals, shorter duration, ideal for REACH. |
| Topical drug formulation, cosmetic ingredient (non-EU regulations) | OECD TG 406 (Buehler) | Topical application without an adjuvant more realistically models human exposure scenarios. |
| Substances suspected of being weak sensitizers, when maximum sensitivity is required | OECD TG 406 (GPMT) | Highest detection capacity thanks to the use of an adjuvant; capable of detecting low-potential sensitizers. |
| Situations where LLNA cannot be applied (e.g., if radioactive labeling is not possible) | OECD TG 406 (GPMT or Buehler) | In specific situations where LLNA alternatives are not suitable, guinea pig tests serve as a backup method. |
| Medical device – permanent implant, long-term skin contact | ISO 10993-10:2021 (GPMT) | High sensitivity provides the best assessment of the potential sensitization risk posed by permanent devices. |
| Medical device – surface device, short-term contact | ISO 10993-10:2021 (Buehler or LLNA) | The topical application or quantitative LLNA option is sufficient for devices with short-term contact and is 3R-compliant. |
| Medical device – mandatory biocompatibility under the EU MDR (2017/745) | ISO 10993-10:2021 | The MDR references the ISO 10993 series for the biocompatibility assessment of medical devices; the sensitization test is mandatory for all devices that come into contact with the skin. |
Modern Alternatives: In Vitro and In Chemico Methods
Today, there are in vitro ve chemico methods—developed as alternatives to animal testing for skin sensitization assessment and validated by the OECD—available. Our laboratory offers these alternative methods as part of its testing portfolio:
| OECD Guidance | Yöntem | Stage of Sensitization Measured | Test Sistemi |
|---|---|---|---|
| TG 442C | Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) | Key step 1: Protein binding (haptenation) | Chemical (in chemico) – synthetic peptides |
| TG 442D | KeratinoSens™ / ARE-Nrf2 Luciferase Assay | Key step 2: Keratinocyte activation | In vitro – human keratinocyte cell line |
| TG 442E | h-CLAT / U-SENS™ / IL-8 Luc Assay | Key Step 3: Dendritic cell activation | In vitro – human monocyte/dendritic cell-like cell lines |
Since these alternative methods can only assess a single stage of sensitization on their own, they provide the highest accuracy when used in combination within the framework of the OECD’s Defined Approach (DA). Since animal testing is prohibited in the EU, particularly for cosmetic products, these in vitro/ chemico methods are the only mandatory option. By applying these modern alternatives, our laboratory is able to provide sensitization assessments for cosmetic and personal care products entirely without the use of animals.
Conducting Skin Sensitization Tests in Our Laboratory
In our GLP- and GMP-certified laboratory, we conduct skin sensitization tests in full compliance with international standards. Our experienced team of toxicologists and veterinary pathologists evaluates your product’s physicochemical properties, chemical structure, and regulatory requirements before each study to recommend the most appropriate testing strategy. We have the infrastructure for radioactive labeling for LLNA and fully implement GPMT and Buehler tests. For medical devices, in accordance with ISO 10993-10:2021, tests are conducted using extracts prepared from your device in compliance with ISO 10993-12, and the results are integrated into your biocompatibility assessment dossier. Furthermore, by offering in vitro/chemico alternatives that do not require the use of animals, we demonstrate the utmost commitment to the 3R principles.
Sık Sorulan Sorular
| Soru Soru Soru Soru | Cevap |
|---|---|
| Can the LLNA always replace the GPMT and the Buehler test? | In most cases, yes. The OECD recommends the LLNA as the primary method and positions guinea pig tests only as a backup for situations where the LLNA cannot be applied. However, some regulatory authorities may require the GPMT for specific product types. |
| Which sensitization test is mandatory for cosmetic products? | Under the EU Cosmetics Regulation (EC 1223/2009), animal testing for cosmetic products and their ingredients is completely prohibited. Therefore, the use of in vitro/chemico methods covered by OECD TG 442C, 442D, and 442E, in conjunction with the Defined Approach (DA), is mandatory. |
| Under what circumstances is a sensitization test required for medical devices? | In accordance with ISO 10993-1, a sensitization assessment is required for all medical devices that come into contact with the skin. Under the EU MDR (2017/745), this data is required in the biocompatibility dossier depending on the device’s class and duration of contact. |
| Can LLNA be used under ISO 10993-10:2021? | Yes. ISO 10993-10:2021 officially recognizes GPMT, Buehler, and LLNA for skin sensitization assessment. LLNA is preferred, especially in cases where compliance with the 3R principles is a priority. |
| How long does it take to receive test results? | LLNA: 3–4 weeks (including reporting). GPMT/Buehler: 6–8 weeks (including reporting). In vitro alternatives: 2–3 weeks. The total duration may vary depending on the workload and quality assurance review. |
| If a substance is to be evaluated both as a chemical and as a medical device component, which test should be performed? | Since the regulatory contexts differ, both evaluations may be required separately. Testing in accordance with OECD TG 429 or TG 406 is appropriate for chemical classification; testing under ISO 10993-10:2021 is appropriate for medical device biocompatibility. Our laboratory offers integrated solutions to meet both of these needs. |
Skin sensitization is a toxicological endpoint that directly affects user safety and cannot be overlooked. Accurately determining the risk of allergic reactions using scientific methods is a critical factor in establishing your product’s reliability and market acceptance. Our laboratory conducts all skin sensitization tests covered by OECD TG 406, OECD TG 429, and ISO 10993-10:2021 in accordance with GLP standards and with the utmost adherence to the 3R principles. To work with us on planning the most appropriate sensitization assessment strategy for your chemical substance or medical device, contact us.
