Pyrogen Test: Scientific Assessment of the Risk of a Fever Response in Parenteral Products

وتخضع العقاقير الوالدية، والطب الأحيائي، واللقاحات، والعلاج الخلوي، وحلول التشفير، والأجهزة الطبية التي تتصل بالدم، لأعلى معايير السلامة لأنها تدار مباشرة في مجرى الدم أو الأنسجة. ويمكن أن يتسبب التلوث بالفيروسينات في هذه المنتجات في استجابة للمرضى، مما يؤدي إلى ظروف سريرية خطيرة. اختبار Pyrogen ويوفر تقييما بيولوجيا لقدرات المنتج أو المواد على إحداث استجابة في الهيئة. مختبرنا يقوم باختبار الـ(بيروجين) وفقاً Ph. Eur. 2.6.8 و USP §151 (ج) المعايير، في إطار مبادئ نظام الأفضليات المعمم ومع فريق من علماء السموم ذوي الخبرة.

The Scientific Basis and Importance of Pyrogen Test

(بيروجينز) هي مواد تسبب استجابة للحمى في الجسم ويمكن أن تشمل هذه المواد الديوتوكسينات البكتيرية (المبيدات الفوقية المستخرجة من جدران الخلايا في البكتيريا الخماسية)، والعناصر الجدارية الخلوية المستمدة من البكتيريا المحتوية على غرام، والملوثات الفيروسية، والمواد الفطرية المستحضرة، والمواد الجسيمية، وحتى بعض العوامل الكيميائية. ويمكن أن تؤدي ردود الفعل الفيروسية إلى ارتفاع الحمى، والبرد، والنفاق، والصدمة الدماغية، وفي حالات نادرة، الموت. لذلك، التقييم الدقيق لتلوث اليورجين—خصوصاً في المنتجات التي تُدار عن طريق الإنترنت—ذو أهمية حيوية

ويوفر اختبار Pyrogen تقييماً شاملاً للأمان لا يغطي فقط الديوتوكسينات المعروفة، بل يشمل أيضاً حالات عدم تسمم الديوتوكسين. In this regard, it fundamentally differs from the LAL (Limulus Amebocyte Lysate) test, which can detect only Gram-negative bacterial endotoxins. وقد تحتوي بعض المنتجات البيولوجية، ومعالجات الخلايا، والتركيبات المعقدة، على حواجز لا يمكن أن يكتشفها اختبار " LAL " ، وبالتالي، لا غنى عن اختبار البيروجين لهذه المنتجات.

وتنبع أهمية اختبار اليورجين أيضا من المتطلبات التنظيمية. وتبيّن الدراسات الأورامية للصيدلة بوضوح الاختبار الإلزامي لمنتجات محددة. فعلى سبيل المثال، في حين أن اختبار البيروجين إلزامي عموماً بالنسبة للمنتجات البيولوجية واللقاحات والعلاجات الخلوية، فإن اختبار القانون النموذجي قد يكون كافياً للتركيبات الكيميائية البسيطة وحلول الدمج. غير أنه قد يكون من الضروري، تبعاً لطبيعة المنتج وعملية التصنيع، إجراء كلا الاختبارين. وتُستخدم نتائج اختبار البيروجين مباشرة لإطلاق المنتجات، وعملية الموافقة التنظيمية، وسلامة المرضى.

Comparative Analysis of Ph. Eur. 2.6.8 and USP <151> Standards

Ph. Eur. 2.6.8 (أوروبيا الأوروبية) USP <151> (أدوية الولايات المتحدة) تشكل الإشارتين الأساسيتين المعترف بهما دولياً لاختبار اليورانيوم. وكلا المعيارين يعتمدان نفس النهج الأساسي: قياس الزيادة في درجة حرارة الاستجمام في أعقاب الإدارة في نموذج أرنب. غير أن هناك بعض الاختلافات الهامة في معايير التصميم والتفسير التجريبيين.

وفي كلا المعيارين، يجري الاختبار على الأرانب الراشدة الصحية (يفضل أن تكون نيوزيلندا بيضاء). وفي البداية، تُستخدم ثلاثة أرانب؛ وإذا كانت النتائج غير حاسمة، يتكرر الاختبار بخمسة أرانب إضافية (ما مجموعه ثمانية أرانب). وتُدار مادة الاختبار عن طريق الوريد الأذني بصورة مباشرة؛ وحجم الحقن هو عادة 10 مليمترات لكل كيلوغرام، على الرغم من أن أحجاماً مختلفة قد تُحدَّد في دراسة كل منتج. ويتم قياس درجة الحرارة بشكل استجمامي؛ وتسجل القراءات على فترات محددة قبل الحقن وبعده (عادة كل ثلاثين دقيقة لمدة ثلاث ساعات).

ومعايير درجة الحرارة الأولية متشابهة في كلا المعيارين: إذ يجب أن تتراوح درجات الحرارة الأولية للأرانب بين 38.0 و39.8 درجة مئوية، ويجب ألا يتجاوز الفرق بين الحيوانات درجة واحدة. غير أن هناك اختلافات في معايير القبول والرفض. According to Ph. Eur. 2.6.8, if the total temperature increase across three rices is 1.15°C or less, the product is considered pyrogen-free; if the total increase exceeds 2.65°C, the product contains pyrogens and the test is considered a failure. وتعتبر النتائج التي تقع بين هذين القيمين موضع شك، ويعاد الاختبار مع خمسة أرانب إضافية. According to USP §151, the acceptance criterion is 1.4°C, and the rejection criterion is 2.8°C. وفي اختبار الرواسب الثمانية، يكون معيار القبول هو 2.80 درجة مئوية بالنسبة للدكتوراه Eur. و3.7 درجة مئوية بالنسبة لشركة USP.

The table below provides a comparative summary of the key characteristics of the Ph. Eur. 2.6.8 and USP <151> standards.

الاختلافات الرئيسية بين اختبار Pyrogen واختبار LAL

The pyrogen test and the LAL test are two evaluation methods that are often confusion but are fundamentally different. اختبار الحرف هو in vitro الطريقة القادرة على الكشف فقط عن إندوتوكسينات البكتيرية المسببة للهجوم (الأدوية الفوقية). ويستند هذا الاختبار إلى المبدأ القائل بأن الليزر المستمد من خلايا الدم في حفرة الخيول (Limulus polyphemus) يبدي رد فعل مستنسخ في وجود إندوتوكسينات. The LAL test is rapid, economical, and provides quantitative results; however, it cannot detect non-endotoxin pyrogens.

اختبار البيروجين من ناحية أخرى in vivo طريقة تغطي جميع أصناف الضفادع ويمكن الكشف عن الديوتوكسينات البكتيرية، والمنتجات البكتريّة ذات الجرم، والملوّثات الفيروسية، والمواد الفطريّة، والجسيمات، والرقائق الكيميائية باستخدام هذا الاختبار. ولهذا السبب، فإن اختبار البيروجين إلزامي، لا سيما بالنسبة للمنتجات البيولوجية واللقاحات والعلاجات الخلوية والتركيبات المعقدة. غير أن اختبار البيروجين يتطلب استخدام الحيوانات، وهو أكثر تكلفة، ويستغرق وقتا أطول، ولا يقدم نتائج كمية (يسفر فقط عن نتائج نوعية تشير إلى وجود أو عدم وجود رعاة).

ويتوقف اختيار اختبار الاستخدام على طبيعة المنتج والمتطلبات المحددة في دراسة الصيدلة. وفي بعض الحالات، قد يكون من الضروري إجراء الاختبارين معا. فعلى سبيل المثال، عندما يلزم تقييم الحد الأقصى للديوتوكسين والوصف العام للتنوع البيولوجي لمنتج بيولوجي، تُستخدم اختبارات اللوتر والبيروجين بصورة مكملة.

Monocyte Activation Test (MAT): A Modern Alternative

"الصيدلية الأوروبية تقبل" Monocyte Activation Test (MAT) كبديل لاختبار بيروجين في ظروف معينة MAT هو in vitro (أ) اختبار يقيس إنتاج الأسطوانية (ولا سيما IL-1بيتا، و IL-6، و TNF-ألفا) بواسطة أحادي البشر استجابة للمواد البيروجينية. وتغطي هذه الطريقة جميع فئات الغوغاء وتقضي على الحاجة إلى اختبار الحيوانات. وتُعتبر ضريبة القيمة المضافة بديلاً واعداً، لا سيما بالنسبة للمنتجات البيولوجية والعلاجات الخلوية.

غير أنه قد يلزم التحقق من صحة المنتجات والموافقة التنظيمية الخاصة بها من أجل الاستعاضة عن اختبار البيروجين. ويجب تقييم مدى ملاءمة ضريبة القيمة المضافة لكل منتج على أساس تركيبة المنتج، وعملية التصنيع، والمصادر المحتملة للرقائق. مختبرنا يُقدّمُ MAT كبديل لاختبارِ pyrogen ويُقدّمُ مشاورةً علميّةً لتحديد أنسب إستراتيجية إختبار لمنتجِكَ.

أيّ منتج تطلب اختبار "بيروجين"؟

ولا بد من إجراء اختبارات للبيروجين لجميع المنتجات التي تُدار مباشرة في مجرى الدم أو الأنسجة التي تنطوي على خطر التلوث باليورجين. ويُعتبر اختبار البيروجين إلزامياً بالنسبة للعقاقير الوالدية (الحلول التي يمكن حقنها، وسوائل التوفير، والعقاقير العابرة للحدود) لأن هذه المنتجات تُدار مباشرة في مجرى الدم، كما أن التلوث باليورجين يشكل خطراً يهدد الحياة. كما أن اختبار Pyrogen إلزامي بالنسبة للمنتجات البيولوجية (الأجسام المضادة للذكور، والبروتينات المتكررة، والأنزيمات، والهرمونات)؛ وخطر التلوث باليورجين مرتفع في عمليات التصنيع البيولوجي، ولا يمكن لاختبار القانون المحلي أن يكشف جميع حالات البلوغين.

ويُعتبر اختبار البيروجين إلزامياً بالنسبة إلى اللقاحات (اللقاحات المنشطة، واللقاحات المكسورة، واللقاحات المتكدسة)؛ وبما أن اللقاحات تحفز مباشرة النظام المناعي، فإن خطر إثارة التصدّي للفيروسينات مرتفع. كما أن اختبار البيروجين إلزامي أيضاً لعلاج الخلايا والجينات (الخلايا الجذعية، خلايا الجذع المغنطيسية، والناقلات الفيروسية)؛ ويمكن أن تكون المصفوفات البيولوجية المعقدة مصدراً لجرعات غير النيتوكسين. وقد يلزم إجراء اختبارات للبيروجين للأجهزة الطبية (الوحدات، والثدييات، وآلات غسيل الكلى، وأكياس الدم)؛ ووفقاً للمعيار ISO 10993-11، قد يلزم تقييم مستخرجات الأجهزة من أجل التطهير.

والاختبار البيروجيني إلزامي بالنسبة للحلول المتعلقة بالغسل الكلوي واللحم )سوائل غسيل الكلى، وحلول تحلل الدم، وحلول الزنجبيل(؛ وتخضع حدود اليورجين لمراقبة صارمة في المنتجات التي تدار بين الوالدين بأحجام كبيرة. وقد يلزم أيضا اختبار البيروجين بالنسبة لمنتجات مواضيعية معينة (الحلول الوراثية، وبعض منتجات رعاية الجروح)؛ وقد يكون من الضروري التحكم باليورجين بالنسبة للمنتجات المطبقة على الأنسجة الحساسة مثل العينين والجروح المفتوحة.

إجراء اختبارات في مختبرنا

In our GLP-certified laboratory, we conduct pyrogen tests in accordance with Ph. Eur. 2.6.8 and USP <151> in full compliance with international standards. Our testing process begins with a comprehensive preliminary evaluation. The physicochemical properties of the test substance, available toxicity data, and the requirements in the pharmacopoeia monograph are reviewed. Based on this information, the most appropriate test protocol and test volume are determined.

الراشدون الصحيون نيوزيلندا الأرانب البيضاء تستخدم للاختبار وتُنفَّذ فترة ما قبل الاختبار مدتها سبعة أيام على الأقل؛ وتتيح هذه الفترة للحيوانات التكيف مع ظروف المختبرات وتخفف من عوامل الإجهاد. ويتم اختيار الأرباع الذين يزنون ما لا يقل عن 1.5 كيلوغرام؛ وينبغي أن تتراوح درجات حرارة جسمهم الأولية بين 38.0 و39.8 درجة مئوية، وينبغي ألا يتجاوز الفرق بين الحيوانات درجة واحدة. ويُفضَّل الحيوانات التي لم تُستخدم في اختبار البيروجين خلال الأسبوعين الماضيين.

وتتم المحافظة على درجة الحرارة والرطوبة في غرفة الاختبار عند مستويات ثابتة (الدرجة الحرارة: 20-24 درجة مئوية؛ الرطوبة: 40 إلى 60 في المائة)؛ وتخفض عوامل الضوضاء والإجهاد إلى أدنى حد. وتُعد مادة الاختبار على النحو المحدد في دراسة المنتجات؛ وتُستخرج جميع المذيبات والمحاقن والمعدات المستخدمة مقدما. وتُدار الحقن ببطء داخل الرحم عن طريق الوريد الأذني؛ وتُصَبَّق الظروف المسببة للآلام بصرامة. وتتخذ مقاييس درجة الحرارة باستخدام مقاييس الحرارة مع شهادات المعايرة أو نظم القياس عن بعد؛ ودقة القياس هي ٠,١ درجة مئوية.

The observation period lasts at least three hours after injection; temperature is recorded every thirty minutes. The maximum increase relative to the baseline temperature is calculated and interpreted according to pharmacopoeia criteria. ويتم الإشراف على الطب البيطري أثناء الاختبار وبعده؛ ويجري التدخل المناسب في حالة حدوث رد فعل شديد. وبعد الاختبار، يسمح للحيوانات بالراحة؛ وينتظر ما لا يقل عن ثمانية وأربعين ساعة قبل إعادة الاستخدام، ويتحقق من أن الرد السابق كان في حدود مقبولة.

ومن المزايا الرئيسية التي يتمتع بها مختبرنا أن نتائج اختبار البيروجين يمكن أن تدمج مباشرة في عروضكم التنظيمية. وتفي تقارير الدراسة الكاملة المتوافقة مع نماذج الصيدلة بمتطلبات الاتحاد الأوروبي والولايات المتحدة والسلطات التنظيمية الدولية الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم، من خلال توفير أساليب تكميلية وخيارية مثل اختبار LAL واختبار تنشيط مونوسيت، أشمل تقييم لسلامة اليورجين لمنتجك.

الأسئلة الشائعة

One of the most common questions we receive regarding pyrogen testing is which standard to choose between Ph. Eur. 2.6.8 and USP <151>. The choice depends on your product’s target market. While the Ph. Eur. standard is used as a reference in the European Union and many international markets, the USP standard applies in the United States and certain other regions. For global markets, a testing strategy compliant with both standards is recommended.

كما يُسألنا في كثير من الأحيان عما إذا كان اختبار القانون المحلي يمكن أن يكون بديلاً لاختبار البيروجين. بالنسبة لبعض المنتجات، نعم؛ بالنسبة للغير، لا. وتحدد الدراسات الصيدلانية الاختبار الإلزامي لمنتجات محددة. وكقاعدة عامة، لا يمكن أن يكون اختبار القانون النموذجي كافيا إلا للتركيبات الكيميائية البسيطة التي تنطوي على خطر الديوتوكسينات؛ ولا بد من اختبار البيروجين للمنتجات البيولوجية والمصفوفات المعقدة.

وهناك أيضاً فضول بشأن ما إذا كان اختبار تنشيط مونوسيتي يمكن أن يكون بديلاً لاختبار البيروجين. نعم، تقبل شركة الصيدلانية الأوروبية ضريبة القيمة المضافة كبديل لاختبار البيروجين في ظروف معينة. The MAT measures cytokine production by human monocyte cells in response to pyrogenic substances and covers all classes of pyrogens. غير أنه قد يلزم التحقق من صحة المنتجات والموافقة التنظيمية. وفيما يتعلق بمدة الاختبار، يستغرق الاختبار نفسه يوماً أو يومين؛ غير أنه، بما في ذلك تطعيم الحيوانات، والفرز المسبق، والإبلاغ، عادة ما تكون المدة الإجمالية أسبوعين أو ثلاثة أسابيع.

Pyrogen testing is one of the cornerstones of the safety of parenteral products and medical devices. With our tests fully compliant with Ph. Eur. 2.6.8 and USP <151> standards, we evaluate your products’ potential to induce a febrile response with the highest scientific rigor. Our GLP-certified laboratory, with its experienced staff and state-of-the-art infrastructure, is your reliable partner for pyrogen testing needs. To demonstrate your product’s pyrogen safety, contact us.