Тест на сенсибилизацию кожи: научная оценка риска аллергического контактного дерматита

Аллергический контактный дерматит является иммунно-опосредованной реакцией гиперчувствительности замедленного типа, которая развивается в ответ на химические вещества и медицинские устройства. Это состояние, распространенность которого в общей популяции неуклонно растет, может быть результатом профессионального воздействия или контакта с потребительскими товарами и медицинскими изделиями. Определение потенциала вещества для сенсибилизации кожи (вызывая аллергию) является ключевым шагом в оценке безопасности химических веществ, косметических ингредиентов, пестицидов, биоцидных продуктов и медицинских устройств. Тестирование сенсибилизации кожи формирует научную основу этой оценки. Наша лаборатория проводит тесты на сенсибилизацию кожи в соответствии со стандартами ОЭСР и ISO, в соответствии с принципами GLP и с полным соблюдением подхода 3R.

Научная основа и значение чувствительности кожи

Сенсибилизация принципиально отличается от других видов локальной токсичности, поскольку эта реакция характеризуется соотношением доза-реакция и иммунной памятью. После сенсибилизации у человека может развиться тяжелая реакция даже при повторном воздействии на очень низкие концентрации. Таким образом, вещество с потенциалом сенсибилизации может представлять серьезную опасность для здоровья населения, даже если оно не проявляет острой токсичности. Аллергический контактный дерматит проявляется как зуд, покраснение, волдыри, шелушение и, в хронических случаях, лихенификация (утолщение кожи). Случаи, вызванные профессиональным воздействием, могут привести к потере рабочего времени и снижению качества жизни.

Процесс сенсибилизации происходит в два этапа. Первый этап, то есть фаза индукции (сенсибилизации), начинается, когда вещество проникает в кожу и взаимодействует с клетками иммунной системы. На этой стадии вещество связывается с белком-носителем, образуя гаптен-белковый комплекс, который затем транспортируется в лимфатические узлы клетками Лангерганса. В лимфатических узлах активируются Т-лимфоциты, формируются субстанционно-специфические клетки памяти. Этот процесс обычно длится 10-15 дней и не вызывает никаких клинических симптомов. Второй этап – это фаза возбуждения (провокации)Это происходит, когда сенсибилизированный человек повторно подвергается воздействию того же вещества. На этот раз быстро активируются Т-лимфоциты памяти, и в течение 24—72 часов развивается воспалительная реакция. По этой причине в тестах на сенсибилизацию должны оцениваться как фазы индукции, так и фазы выталкивания.

Данные сенсибилизации кожи непосредственно используются для определения утверждений об опасности и пиктограмм, используемых в маркировке продукции, для подготовки паспортов безопасности (SDS), для определения пределов профессионального воздействия и для формулирования рекомендаций для средств индивидуальной защиты. Кроме того, эти данные являются обязательным требованием для нормативных документов на косметические продукты, чистящие средства и медицинские устройства.

OECD TG 406: традиционные тесты на чувствительность

ОЭСР TG 406 Это классика in vivo Руководство по тестированию используется для оценки потенциала сенсибилизации кожи химических веществ. В этом руководстве определены два различных метода: тест максимизации гвинейской свиньи (GPMT) и тест Бюлера. Оба метода используют модель морской свинки, и основной принцип включает в себя оценку аллергической реакции посредством применения вызова (провокации) через определенное время после фазы индукции с исследуемым веществом.

GPMT (Guinea Pig Maximization Test) Это высокочувствительный метод, который усиливает иммунную систему с помощью адъюванта (Freund’s Complete Adjuvant — FCA), тем самым позволяя обнаруживать даже вещества с низким потенциалом сенсибилизации. Индукция достигается за счет сочетания внутрикожных инъекций и местного применения. Использование адъюванта усиливает иммунный ответ, позволяя обнаружить даже слабые сенсибилизаторы. По этой причине GPMT является предпочтительным для оценки промышленных химикатов, пестицидов и низкопотенциальных сенсибилизаторов.

Тест БюлераС другой стороны, адъювант не используется; индукция достигается исключительно путем местного применения. Следовательно, тест Булера моделирует сценарии воздействия на человека более реалистично, но имеет более низкую чувствительность по сравнению с GPMT. В то время как тест Бюлера является предпочтительным для актуальных лекарств и косметических ингредиентов, GPMT больше подходит для промышленных химикатов и пестицидов. В обоих методах оценка выполняется путем классификации кожных реакций (эритема и отек) через 24 и 48 часов после испытания.

OECD TG 429: Local Lymph Node Assay (LLNA) - Современный и количественный подход

ОЭСР TG 429 Это современная альтернатива с использованием мышиной модели, которая предлагает значительные преимущества перед тестами морских свинок при оценке сенсибилизации кожи. Локальный анализ лимфатических узлов (LLNA) является первым проверенным in vivo Метод, который измеряет индукционную фазу сенсибилизации и выражает результаты количественно. Основной принцип теста включает местное применение тестируемого вещества к коже уха мыши с последующим измерением пролиферации лимфоцитов в региональных (аурикулярных) лимфатических узлах с использованием радиоактивно меченного тимидина.

Наиболее существенные преимущества LLNA по сравнению с методами GPMT и Buehler заключаются в следующем: Он дает количественные результаты; потенциал сенсибилизации выражается численно путем расчета индекса стимуляции (SI). Значение EC3 указывает на эффективную концентрацию, при которой тестируемое вещество вызывает стимуляцию со скоростью три процента и позволяет проводить сравнительную оценку потенциала сенсибилизации. Это требует меньшего количества животных и более короткой продолжительности; в то время как GPMT требует 20–30 морских свинок и 4–6 недель, LLNA требует только 16–20 мышей и 1-2 недели. Это 3R-совместимо; LLNA лучше согласуется с принципами сокращения (меньше животных) и уточнения (менее инвазивные процедуры). Она дает объективную оценку; поскольку она основана на измерении радиоактивности, а не на визуальном скоринге, субъективные суждения сводятся к минимуму.

В настоящее время ОЭСР рекомендует LLNA (TG 429) в качестве основного метода оценки сенсибилизации кожи к химическим веществам; он позиционирует тесты морских свинок (TG 406) в качестве резервного метода только для конкретных случаев, когда LLNA не может быть применена.

ISO 10993-10: Оценка чувствительности кожи для медицинских устройств

ISO 10993-10 Международный стандарт, определяющий тесты сенсибилизации кожи в рамках оценки биосовместимости медицинских изделий. Этот стандарт включает в себя методы тестирования, которые используют экстракты, полученные из устройства или самого материала устройства, для оценки потенциала аллергического контактного дерматита, создаваемого медицинскими устройствами и биоматериалами. В соответствии с ISO 10993-10 для оценки сенсибилизации кожи рекомендуется использовать три основных метода: GPMT, тест Бюлера и LLNA. В стандарте говорится, что на основе данных химической характеристики и существующей литературы в некоторых случаях оценка сенсибилизации может быть завершена без тестирования на животных.

Наиболее существенное различие между ISO 10993-10 и предыдущими версиями заключается в принятии риск-ориентированного подхода к выбору метода тестирования и его ссылки на использование стандарта. in vitro/в Химико Альтернативные методы. Стандарт требует оценки сенсибилизации для всех медицинских устройств, которые вступают в контакт с кожей; однако объем и метод теста определяются на основе продолжительности и типа контакта.

В приведенной ниже таблице кратко излагаются основные руководящие принципы, используемые при оценке сенсибилизации кожи, и их характеристики.

Современные альтернативы: методы in vitro и in Chemico

Сегодня есть in vitro и в Химико методы—Разработан в качестве альтернативы тестированию на животных для оценки сенсибилизации кожи и подтвержден ОЭСР—Они все более предпочтительны, потому что они соответствуют принципам 3R и обеспечивают более быстрые, экономичные и воспроизводимые результаты.

OECD TG 442C (DPRA – Direct Peptide Reactivity Assay) является в Химико Тест, который оценивает связывание белка (гаптенацию), первый ключевой шаг в сенсибилизации. Он измеряет потенциал тестируемого вещества реагировать с синтетическими пептидами. OECD TG 442D (KeratinoSensTM / ARE-Nrf2 Luciferase Assay) является in vitro Тест, который оценивает активацию кератиноцитов, использует клеточную линию кератиноцитов человека. OECD TG 442E (H-CLAT / U-SENSTM / IL-8 Luc Test) является in vitro Тест, который оценивает активацию дендритных клеток; используются моноцитные/дендритные клеточные линии человека.

Поскольку эти альтернативные методы могут оценивать только одну стадию сенсибилизации самостоятельно, они обеспечивают наивысшую точность при использовании в сочетании в рамках ОЭСР. Определенный подход (DA)Поскольку тестирование на животных запрещено в ЕС, в частности, для косметических продуктов, эти продукты запрещены. in vitro/в Химико Методы являются единственным обязательным вариантом. Используя эти современные альтернативы, наша лаборатория может проводить оценку сенсибилизации косметических средств и средств личной гигиены без использования животных.

Классификация GHS и категории чувствительности кожи

Результаты теста на сенсибилизацию кожи подразделяются на две основные категории в соответствии с критериями Глобальной Гармонизированной Системы (GHS). Категория 1 (Сенсибилизация кожи) указывает на то, что вещество может вызвать аллергическую реакцию после контакта с кожей. Эта категория обозначена надписью «Может вызвать аллергическую реакцию кожи» и отмечена пиктограммой восклицательного знака (GHS07). Подкатегория 1A (Strong Sensitizer) охватывает вещества, вызывающие реакции с высокой частотой и тяжестью; подкатегория 1B (Weak/Moderate Sensitizer) охватывает вещества, вызывающие реакции с более низкой частотой. Эти подкатегории особенно важны при определении мер по управлению рисками.

С другой стороны, несекретными веществами являются те, которые не демонстрируют потенциал сенсибилизации кожи на основе имеющихся данных. Эта классификация непосредственно используется для определения многочисленных нормативных требований, начиная от маркировки продукта до транспортировки, хранения и инструкций по использованию. Неправильная или неполная классификация может привести как к юридическим санкциям, так и к нарушению безопасности пользователей.

Проведение тестов на сенсибилизацию кожи в нашей лаборатории

В нашей сертифицированной GLP и GMP лаборатории мы проводим тесты на сенсибилизацию кожи в полном соответствии с международными стандартами. Наша опытная команда токсикологов и ветеринарных патологоанатомов оценивает физико-химические свойства вашего продукта, химическую структуру и нормативные требования перед каждым исследованием, чтобы рекомендовать наиболее подходящую стратегию тестирования. У нас есть инфраструктура для радиоактивной маркировки LLNA, и мы полностью выполняем испытания GPMT и Buehler.

Для медицинских изделий, в соответствии с ISO 10993-10:2021, тестирование проводится с использованием экстрактов, полученных с вашего устройства в соответствии с ISO 10993-12, и результаты интегрированы в ваше досье оценки биосовместимости. Кроме того, предлагая in vitro/в Химико Альтернативы, которые не требуют использования животных, демонстрируют максимальную приверженность принципам 3R.

Одним из ключевых преимуществ нашей лаборатории является возможность непосредственно интегрировать результаты испытаний в ваши нормативные документы. Полные отчеты об исследованиях, соответствующие шаблону ОЭСР, соответствуют требованиям EU REACH, CLP Regulation, U.S. EPA FIFRA, TSCA, EU MDR (2017/745) и турецкого KKDIK. Кроме того, мы предоставляем все необходимые данные в полном объеме для подготовки паспорта безопасности вашего продукта (SDS).

Часто Задаваемые Вопросы

Один из наиболее распространенных вопросов, которые мы получаем в отношении тестирования сенсибилизации кожи, заключается в том, может ли LLNA заменить GPMT и тест Бюлера во всех случаях. В большинстве случаев да; ОЭСР рекомендует LLNA в качестве основного метода и позиционирует тесты на морских свинках только в качестве резервной копии для ситуаций, когда LLNA не может быть применена. Однако некоторые регулирующие органы могут потребовать ГПМТ для конкретных типов продукции.

Часто задают вопрос, какой тест является обязательным для косметических продуктов. Согласно Регламенту ЕС по косметике (EC 1223/2009), тестирование на животных косметических продуктов и их ингредиентов полностью запрещено. Таким образом, использование in vitro/в Химико Методы, охватываемые OECD TG 442C, 442D и 442E, в сочетании с Определенным подходом (DA), являются обязательными.

Что касается обстоятельств, при которых тест на сенсибилизацию является обязательным для медицинских устройств, ответ заключается в том, что в соответствии с ISO 10993-1 для всех медицинских устройств, которые вступают в контакт с кожей, требуется оценка сенсибилизации. В соответствии с EU MDR (2017/745) эти данные необходимы в досье биосовместимости в зависимости от класса устройства и продолжительности контакта. Что касается продолжительности теста, LLNA занимает 3-4 недели, тест GPMT/Buehler занимает 6-8 недель, а также in vitro Альтернативы занимают 2-3 недели. Общая продолжительность может варьироваться в зависимости от интенсивности исследования и проверки качества.

Сенсибилизация кожи является токсикологической конечной точкой, которая непосредственно влияет на безопасность пользователя и не может быть пропущена. Точное определение риска аллергических реакций с использованием научных методов является критическим фактором в установлении надежности и приемлемости вашего продукта на рынке. Наша лаборатория предлагает все тесты сенсибилизации кожи, охватываемые OECD TG 406, OECD TG 429 и ISO 10993-10 в соответствии со стандартами GLP и с максимальной приверженностью принципам 3R. Чтобы работать с нами над планированием наиболее подходящей стратегии оценки сенсибилизации для вашего химического вещества или медицинского устройства, свяжитесь с нами.